Name: 1차 인간 T 세포의 분리, 배양 및 일시적 형질인화를 통해 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 배우세요 1차 인간 T 세포의 분리, 활성화, 확장 및 mRNA 전기천공을 통한 일시적 CAR 형질인화 방법. 이 프로토콜은 CAR 구조체의 신속한 평가와 면역치료 연구에 필수적인 기술을 제공합니다.

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<ol><li>Bartelt, R. R., Cruz-Orcutt, N., Collins, M., Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T+cell+receptor-induced+proximal+signaling+and+downstream+functions+in+immortalized+and+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of T cell receptor-induced proximal signaling and downstream functions in immortalized and primary T cells.</a> PLoS One. 4 (5), e5430(2009).</li>
<li>Smeets, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathway+profiling+of+T+lymphocyte+signal+transduction+pathways%3B+Th1+and+Th2+genomic+fingerprints+are+defined+by+TCR+and+CD28-mediated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathway profiling of T lymphocyte signal transduction pathways; Th1 and Th2 genomic fingerprints are defined by TCR and CD28-mediated signaling.</a> BMC Immunol. 13 (12), (2012).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jurkat+T-cell+lines+exhibit+marked+genomic+instability+affecting+karyotype%2C+mutational+profile%2C+gene+expression%2C+immunophenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Jurkat T-cell lines exhibit marked genomic instability affecting karyotype, mutational profile, gene expression, immunophenotype and function.</a> Sci Rep. 15 (1), 22426(2025).</li>
<li>Dobersberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineering+strategy+to+target+activated+EGFR+with+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells.</a> Cell Rep Methods. 4 (4), 100728(2024).</li>
<li>Van Bruggen, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lymphocytic+leukemia+cells+impair+mitochondrial+fitness+in+CD8%2B+T+cells+and+impede+CAR+T-cell+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chronic lymphocytic leukemia cells impair mitochondrial fitness in CD8+ T cells and impede CAR T-cell efficacy.</a> Blood. 134 (1), 44-58 (2019).</li>
<li>Hoffmann, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+expansion+potential+of+naive+chimeric+antigen+receptor+T+cells+from+healthy+donors+and+untreated+chronic+lymphocytic+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differences in expansion potential of naive chimeric antigen receptor T cells from healthy donors and untreated chronic lymphocytic leukemia patients.</a> Front Immunol. 8 (1956), (2017).</li>
<li>Zhang, D. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+CAR-T+cell+functionality+in+a+patient-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner.</a> Nat Commun. 14 (1), 506(2023).</li>
<li>Li, Y., Kurlander, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-CD3+and+anti-CD28-coated+beads+with+soluble+anti-CD3+for+expanding+human+T+cells%3A+differing+impact+on+CD8+T+cell+phenotype+and+responsiveness+to+restimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation.</a> J Transl Med. 8 (104), (2010).</li>
<li>Xu, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+comparative+analysis+reveals+differential+impacts+of+various+cytokines+on+CART+cell+phenotype+and+function+ex+vivo+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Multiparameter comparative analysis reveals differential impacts of various cytokines on CART cell phenotype and function ex vivo and in vivo.</a> Oncotarget. 7 (50), 82354-82368 (2016).</li>
<li>Cornish, G. H., Sinclair, L. V., Cantrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+T-cell+growth+by+IL-2+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of T-cell growth by IL-2 and IL-15.</a> Blood. 108 (2), 600-608 (2006).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Foster, J. B., Barrett, D. M., Kariko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+in+vitro-transcribed+mRNA+in+adoptive+T+cell+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">The emerging role of in vitro-transcribed mRNA in adoptive T cell immunotherapy.</a> Mol Ther. 27 (4), 747-756 (2019).</li>
<li>Becker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+effectiveness+of+gammadelta+T+cells+by+mRNA+transfection+of+chimeric+antigen+receptors+or+bispecific+T+cell+engagers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Enhancing the effectiveness of gammadelta T cells by mRNA transfection of chimeric antigen receptors or bispecific T cell engagers.</a> Mol Ther Oncolytics. 29, 145-157 (2023).</li>
<li>Wiesinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-scale+production+of+CAR-T+cells+for+the+treatment+of+melanoma+patients+by+mRNA+transfection+of+a+CSPG4-specific+CAR+under+full+GMP+compliance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Clinical-scale production of CAR-T cells for the treatment of melanoma patients by mRNA transfection of a CSPG4-specific CAR under full GMP compliance.</a> Cancers (Basel). 11 (8), 1198(2019).</li>
<li>Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+meets+mRNA+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology.</a> Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).</li>
<li>Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-based+therapeutics--developing+a+new+class+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 759-780 (2014).</li>
<li>Underwood, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activators+exhibit+distinct+downstream+effects+on+chimeric+antigen+receptor+T+cell+phenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunohorizons%22%5BJournal%5D)">T cell activators exhibit distinct downstream effects on chimeric antigen receptor T cell phenotype and function.</a> Immunohorizons. 8 (6), 404-414 (2024).</li>
<li>Zajc, C. U., Teufl, M., Traxlmayr, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+and+stability+analysis+of+yeast+displayed+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Affinity and stability analysis of yeast displayed proteins.</a> Methods Mol Biol. 2491, 155-173 (2022).</li>
<li>Seigner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+mystery+of+the+FMC63-CD19+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Solving the mystery of the FMC63-CD19 affinity.</a> Sci Rep. 13 (1), 23024(2023).</li>
<li>Jalkanen, A. L., Coleman, S. J., Wilusz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+and+implications+of+mRNA+poly%28A%29+tail+size--does+this+protein+make+my+tail+look+big%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Determinants and implications of mRNA poly(A) tail size--does this protein make my tail look big.</a> Semin Cell Dev Biol. 34, 24-32 (2014).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mRNA+encoding+a+chimeric+antigen+receptor+is+critical+for+the+generation+of+a+robust+T-Cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Purification of mRNA encoding a chimeric antigen receptor is critical for the generation of a robust T-Cell response.</a> Hum Gene Ther. 30 (2), 168-178 (2019).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-mRNA+for+transient+CAR+T+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimal chimeric antigen receptor (CAR)-mRNA for transient CAR T cell generation.</a> Int J Mol Sci. 26 (3), 965(2025).</li>
<li>Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+assays+to+measure+CAR+T-cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonviral+approach+to+generate+transient+chimeric+antigen+receptor+T+cells+using+mRNA+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A nonviral approach to generate transient chimeric antigen receptor T cells using mRNA for cancer immunotherapy.</a> J Vis Exp. (216), e67548(2025).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+mRNA+CAR+T+cells+targeting+GD2+provide+dose-adjusted+efficacy+against+diffuse+midline+glioma+and+high+grade+glioma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Transient mRNA CAR T cells targeting GD2 provide dose-adjusted efficacy against diffuse midline glioma and high grade glioma models.</a> Neuro Oncol. 27 (10), 2684-2696 (2025).</li>
<li>Usheva, Z. I., Petersen, D. L., Barington, T., Mouritzen, P., Barnkob, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+cytotoxicity+assay+to+assess+chimeric+antigen+receptor+T+cells+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Droplet-based cytotoxicity assay to assess chimeric antigen receptor T cells at the single-cell level.</a> J Vis Exp. (217), e67657(2025).</li>
<li>Subham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+cytotoxicity+evaluation+of+Jurkat+expressing+chimeric+antigen+receptor+using+fluorescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro cytotoxicity evaluation of Jurkat expressing chimeric antigen receptor using fluorescent imaging.</a> J Vis Exp. (200), e65560(2023).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+primary+human+and+mouse+T+lymphocytes+using+RNA+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of primary human and mouse T lymphocytes using RNA electroporation.</a> Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Clausen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+the+activation-associated+receptors+CD25+and+CD69+on+human+NK-cells+and+NK-like+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Functional significance of the activation-associated receptors CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells.</a> Immunobiology. 207 (2), 85-93 (2003).</li>
<li>Poloni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation-induced+marker+assays+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T-cell activation-induced marker assays in health and disease.</a> Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).</li>
<li>Rotta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+flow+cytometry+immunophenotyping+of+human+antigen-specific+T+cells+by+activation-induced+marker+and+Th1+cytokine+detection%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for flow cytometry immunophenotyping of human antigen-specific T cells by activation-induced marker and Th1 cytokine detection.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103343(2025).</li>
<li>Elsallab, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+primary+malignancies+after+commercial+CAR+T-cell+therapy%3A+analysis+of+the+FDA+adverse+events+reporting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Second primary malignancies after commercial CAR T-cell therapy: analysis of the FDA adverse events reporting system.</a> Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).</li>
<li>Verdun, N., Marks, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+cancers+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Secondary cancers after chimeric antigen receptor T-cell therapy.</a> N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).</li>
<li>Krug, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+activity+of+MCSP-specific+chimeric+antigen+receptors+%28CARs%29+depend+on+the+scFv+antigen-binding+domain+and+the+protein+backbone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Stability and activity of MCSP-specific chimeric antigen receptors (CARs) depend on the scFv antigen-binding domain and the protein backbone.</a> Cancer Immunol Immunother. 64 (12), 1623-1635 (2015).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+outperform+electroporation+in+mRNA-based+CAR+T+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles outperform electroporation in mRNA-based CAR T cell engineering.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101139(2023).</li>
<li>Sauerer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mRNA+as+a+universal+technology+platform+to+transfect+a+variety+of+primary+cells+with+antigens+and+functional+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mRNA as a universal technology platform to transfect a variety of primary cells with antigens and functional proteins.</a> Methods Mol Biol. 2786, 219-235 (2024).</li>
<li>Bimbo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-specific+non-viral+DNA+delivery+and+in+vivo+CAR-T+generation+using+targeted+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">T cell-specific non-viral DNA delivery and in vivo CAR-T generation using targeted lipid nanoparticles.</a> J Immunother Cancer. 13 (7), (2025).</li>
<li>Hudecek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+non-viral%3A+the+Sleeping+Beauty+transposon+system+breaks+on+through+to+the+clinical+side%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).</li>
<li>Prommersberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircles+for+CAR+T+cell+production+by+sleeping+beauty+transposition%3A+a+technological+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Minicircles for CAR T cell production by sleeping beauty transposition: a technological overview.</a> Methods Mol Biol. 2521, 25-39 (2022).</li>
<li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+system%3A+a+non-viral+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum Mol Genet. 20 (R1), R14-R20 (2011).</li>
<li>Soundara Rajan, T., Gugliandolo, A., Bramanti, P., Mazzon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-Transcribed+mRNA+chimeric+antigen+receptor+T+cell+%28IVT+mRNA+CAR+T%29+therapy+in+hematologic+and+solid+tumor+management%3A+A+preclinical+update%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro-Transcribed mRNA chimeric antigen receptor T cell (IVT mRNA CAR T) therapy in hematologic and solid tumor management: A preclinical update.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).</li>
<li>Granit, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+clinical+activity+of+autologous+RNA+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+in+myasthenia+gravis+%28MG-001%29%3A+a+prospective%2C+multicentre%2C+open-label%2C+non-randomised+phase+1b%2F2a+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Safety and clinical activity of autologous RNA chimeric antigen receptor T-cell therapy in myasthenia gravis (MG-001): a prospective, multicentre, open-label, non-randomised phase 1b/2a study.</a> Lancet Neurol. 22 (7), 578-590 (2023).</li>
<li>Dagher, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+efficacy+of+multi-targeting+mRNA-based+CAR+T+cell+therapy+in+resection+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Preclinical efficacy of multi-targeting mRNA-based CAR T cell therapy in resection models of glioblastoma.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 36 (3), 102676(2025).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes, High Performance</td><td>VWR</td><td>525-1164</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates, flat bottom, TC-treated&nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates, flat bottom, TC-treated</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates, flat bottom, TC-treated&nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD staining solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-568</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag DYKDDDDK Antibody, APC, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-119-584</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Clinical Flow Cytometry System</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Merck</td><td>A4503-10G</td><td>중력 흐름 분리용</td></tr><tr><td>CD134 (OX40) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-126-048</td><td>Conjugate: PE</td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-764</td><td>Conjugate: APC</td></tr><tr><td>CD154 (CD40L) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-142</td><td>Conjugate: PerCP-VIO 700</td></tr><tr><td>CD25 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-541</td><td>Conjugate: PE-Vio 770</td></tr><tr><td>CD3 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-352</td><td>Conjugate: PE-Vio 670</td></tr><tr><td>CD4 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-223</td><td>Conjugate: APC-Vio 770</td></tr><tr><td>CD4 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td>중력 흐름 분리용</td></tr><tr><td>CD45 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-775</td><td>Conjugate: VioBlue</td></tr><tr><td>CD45RA Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-270</td><td>Conjugate: Vio Bright V600</td></tr><tr><td>CD62L Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-127-499</td><td>Conjugate: Vio Bright R720</td></tr><tr><td>CD69 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-800</td><td>Conjugate: VioGreen</td></tr><tr><td>CD8 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-677</td><td>Conjugate: FITC</td></tr><tr><td>CD8 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-201</td><td>중력 흐름 분리용</td></tr><tr><td>Cellstar 96 Well Suspension Culture Plate, U-bottom</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650 185</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810&nbsp;R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator ICO150</td><td>Memmert</td><td>ICO150</td><td></td></tr><tr><td>CoolNat Ice Machine</td><td>Ziegra Eismaschinen GmbH</td><td>ZBE 30-10</td><td></td></tr><tr><td>Corning CoolCell Freezer Container</td><td>Corning</td><td>CLS432000</td><td></td></tr><tr><td>Counting chamber, B&uuml;rker-T&uuml;rk pattern, BLAUBRAND</td><td>Brand</td><td>719520</td><td></td></tr><tr><td>CryoPure tubes, 2 mL, QuickSeal screw cap</td><td>Sarstedt</td><td>72,380</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX LX Flow Cytometer</td><td>Beckmann Coulter</td><td>C11185</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) Cell culture grade</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes with 4 mm gap size, yellow cap</td><td>VWR</td><td>732-1137</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 0.1&ndash;2.5 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 100&ndash;1000 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 2&ndash;20 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 20&ndash;200 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Merck</td><td>E6758-100G</td><td>중력 흐름 분리용</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL PP Centrifuge Tube, Conical Bottom</td><td>Corning</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL PP Centrifuge Tube, Conical Bottom</td><td>Corning</td><td>325098</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Value FBS</td><td>Gibco</td><td>A52567-01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375-10G</td><td>밀도 구배 분리용</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Sterile Graduated Transfer Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13469108</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total System</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td>PC Module 및 CE Module 포함</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (with tailing)</td><td>New England Biolabs</td><td>E2060S</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-15, research grade</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-955</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-7, research grade</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-367</td><td></td></tr><tr><td>Integra Biosciences Corp&nbsp;PIPETBOY acu 2 pipet aid</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0085685</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>중력 흐름 분리용</td></tr><tr><td>Microplate, 96 well, PS, V-bottom, clear, non-binding</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651901</td><td></td></tr><tr><td>Monarch RNA Cleanup

1차 인간 t 세포의 분리, 배양 및 일시적 형질인화를 통해 키메라 항원 수용체(car) t 세포를 생성하는 방법

Isolation, Cultivation, and Transient Transfection of Primary Human T Cells to Generate Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells

1차 인간 T 세포의 활성화 및 증식 원발 T 세포는 0일째에 CD3/28 구슬 또는 TransAct로 해동 및 활성화되었으며, 23일간 증식하고 2-3일마다 수치했습니다(그림 2A). 개수일에는 세포 밀도를 0.3-0.5 x 106 cells/mL로 조정했습니다. 2020년 0월 2일, 5일, 9일, 14일째에 T 세포를 이용해 활성화 마커의 표현형과 발현을 평가하는 유세포 분석을 수행하였습니다. 활성화 후 첫 주 이내에 T 세포는 두 활성화 시약(그림 2B)으로 빠르게 증식하고 확장되었으며, TransAct로 활성화된 T 세포는 이후 며칠간 접힘 확장이 약간 낮았습니다(그림 2C). 특히, T 세포의 활성화는 현미경 분석으로도 관찰되었으며, 활성화 시약 주변에 T 세포 클러스터가 형성되었습니다(그림 2D).
<img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
그림 2: 두 가지 다른 활성화 시약을 사용한 1차 T 세포의 활성화 및 증식. (A) 실험 타임라인의 도식적 표현. 세포는 0일째에 CD3/28 비드 또는 TransAct로 활성화되어 23일간 배양되었습니다. 파란색 점은 세포 수가 세어진 날을, 빨간 점은 세포가 유동세포분석으로 분석된 날을, 보라색 점은 두 가지 분석을 모두 수행한 날을 나타냅니다. (B) 및 (C) 배양 후 첫 주 동안 (B) 또는 (C) 배양 후 16일 이내에 일차 T 세포의 증식. 값은 4명(CD3/28 비즈) 또는 3명(TransAct)의 서로 다른 건강한 T 세포 기증자의 평균 표준편차± 기준을 나타냅니다. (D) 활성화 후 1일과 2일에 눈에 띄는 세포 군집이 있는 활성화된 T 세포의 대표적인 현미경 이미지. 이미지는 역현미경으로 촬영되었습니다. 자(자)는 200 μm에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig2large.jpg" target="_blank">이 도표의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.</a>
T 세포 표현형 및 활성화 마커의 염색 유세포분석 시에는 다음과 같은 게이팅 전략이 적용되었습니다(그림 3): 첫 번째 게이트(FSC-높이 vs. SSC-높이)를 적용해 세포 이물질과 구슬을 제거하고, 이어서 단일 세포에 대해 게이팅(FSC-폭 vs. SSC-면적)을 적용했습니다. CD3+ 세포의 비율은 98-100% 범위여야 합니다. 추가 서브게이팅을 통해 CD4+ (보조) T 세포와 CD8+ (세포독성) T 세포의 비율이 산출되었고, 이들은 CD45RA와 CD62L 마커를 사용하여 서로 다른 표현형 T 세포 소집합에 대해 추가로 게이트화되었습니다. CD3+ T 세포는 활성화 마커(CD25/CD69/CD134/CD137/CD154)의 발현을 위해 추가로 분석되었습니다.
<img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
그림 3: 유세포분석 게이팅 전략. 5일째에 CD3/28 구슬로 활성화된 한 T 세포 기증자의 대표적인 점플롯이 나타났습니다(n = 4). 약어; TEMRA = T 효과기 기억 세포가 CD45RA를 재발현하는 경우; TSCM = 줄기세포 유사 기억 T 세포; TEM = 효과기 기억 T 세포; TCM = 중앙 기억 T 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>
CD3/28 구슬로 활성화된 후 CD4+ T 세포의 비율은 시간이 지남에 따라 감소했으며, 5일째에는 74.3%(± 7.4%)가 활성화 후 20일째에는 14.6%(± 3.4%)로 감소했습니다. CD8+ T 세포 비율은 5일차 20.7%(± 6.4%)에서 20일차에는 82.4%(± 3.1%)로 증가했습니다(그림 4A). TransAct 활성화 후에도 유사한 경향이 관찰되었으며, 20일차에 CD8+ T 세포 비율이 약간 낮았으며(72.5% ± 0.7%). 따라서 TransAct 활성화 후 관찰된 약간 느린 T 세포 확장은 확장 기간 동안 CD8+ 비율이 낮고 CD4+ 세포 비율이 높았음을 의미합니다. T 세포 표현형 구성의 차이는 두 활성화 시약 모두에서 유사하게 나타났습니다(그림 4B). 그러나 CD45RA를 재발현하는 T 효과 기억 세포(TEMRA)의 빈도는 CD8+ 세포가 CD4+ 세포보다 전반적으로 더 높았습니다. 이에 따라 CD4+ T 세포는 중추 기억 T 세포(TCM)와 줄기세포 유사 기억 T 세포(TSCM) 비율이 더 높았습니다(그림 4B).
CD134는 T 세포 해동 후 이미 상향 조절된 유일한 활성화 마커로, CD3/28 비드에서 CD134+ T 세포가 37.6%(± 4.1%), TransAct 활성화 T 세포에서 CD134+ T 세포가 36.1%(±4.4%)로 활성화되었습니다(그림 4C). 두 활성화 전략 모두에서 CD25, CD69, CD134는 2일째에 매우 상향 조절되었습니다. CD3/28 구슬의 경우, CD69와 CD134 발현은 2일째에 정점에 도달했고, CD25는 5일째에 정점을 찍었습니다. TransAct 활성화된 T 세포에서도 유사한 결과가 나타났습니다. CD134와 CD154는 CD3/28 구슬과 TransAct 활성화 세포 모두에서 14일째에만 상향 조절되었습니다. 전반적으로 두 활성화 시약 간 관찰된 경향은 매우 유사했습니다. 그러나 14일째 CD69 발현은 TransAct T세포보다 약간 높았으며(97.1% ± 0.9% 대 86.5% ± 5.1%). 이는 CD3/28 구슬 활성화 세포에서 관찰되는 높은 증폭률이 장기간 지속되는 것과 일치합니다. 요약하자면, 제안된 활성화 마커 패널에는 활성화 후 초기 및 후기 시점 모두에서 상향 조절되는 마커가 포함되어 있으며, 각기 다른 활성화 마커 간 민감도는 다르지만 전반적으로 두 활성화 시약 모두 유사한 경향을 보입니다.
<img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
그림 4: 20일간의 배양 기간 동안 다양한 활성화 시약을 사용한 T 세포 표현형 및 활성화 마커 발현 분석. (A) CD3/28 구슬(왼쪽) 또는 TransAct(오른쪽)로 활성화된 후 배양 중 CD4+/CD8+ T 세포의 비율. (B) 활성화 후 CD3/28 비드(왼쪽 패널 두 개) 또는 트랜스액트(오른쪽 패널 두 개)로 활성화된 T 세포 분화, 각각 CD4+ 또는 CD8+ 세포에 대해 검사합니다. 표현형은 CD45RA와 CD62L 마커를 사용하여 평가하였습니다. TEMRA: CD45RA+ CD62L-, TEM: CD45RA- CD62L-, TCM: CD45RA-CD62L+, TSCM: CD45RA+ CD62L+. (C) CD3/28 비즈 또는 TransAct 활성화 후 및 확장 기간 동안 활성화 마커의 발현. 모세포 집단인 CD3+ T 세포의 빈도[%]가 나타났으며(4개 [CD3/28 구슬] 또는 3개 [TransAct]의 서로 다른 건강한 T 세포 기증자의 평균 ± 표준편차). 약어; TEMRA = T 효과기 기억 세포가 CD45RA를 재발현하는 경우; TSCM = 줄기세포 유사 기억 T 세포; TEM = 효과기 기억 T 세포; TCM = 중앙 기억 T 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>
일차 T 세포의 일시적 형질전환 및 CAR 발현 분석 1차 T 세포는 활성화 후 7일째에 CD3/28 비즈 또는 TransAct로 전기천공을 통해 mRNA를 형질질전환하였습니다. 템플릿으로는 CD28 공동 자극 도메인과 CD3ζ 신호 도메인을 가진 2세대 CAR 표적 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 4(CSPG4)용 mRNA 인코딩이 사용되었습니다. DYKDDDDK 태그(플래그 태그)가 포함되어 유세포 측정 검출을 가능하게 했습니다. T 세포 생존력과 CAR 발현은 전기천공 후 3, 6, 24, 48시간에 평가되었습니다. 염색은 프로토콜 6절에 설명된 대로 수행되었습니다.
전해천공 후 3시간 동안 CD3/28 비드 및 TransAct 활성화 T 세포의 생존율은 낮았으나, 전반적으로 형질전환된 CAR T 세포의 생존율은 51%에서 85% 사이였으며 두 활성화 전략 간에 유의미한 차이는 없었다(그림 5A). 전기천공 이후 이미 이 초기 시점에서 CAR가 검출되었습니다. CAR+ 세포의 비율은 시간이 지남에 따라 점차 감소했으나, 전기천공 후 24시간 이내에 가장 빈도의 CAR+ 세포가 검출되었습니다(그림 5B, 왼쪽 패널). 특히, 전기천공 후 첫 6시간 동안 신호 세기는 안정적이었으나 이후 점차 감소했다(그림 5B, 오른쪽 패널). 48시간 후에는 CAR 발현이 거의 사라져 세포 조작의 일시적 특성과 하위 분석의 초기 시간 창 선택의 중요성을 보여주었습니다. 한 기증자의 CAR 발현을 대표하는 점 플롯은 그림 5C에 나와 있습니다. 두 활성화 시약 모두에서 CD4/CD8 비율은 CAR와 모크 형질전환 세포 간에 차이가 없었습니다(그림 5D). 이전 결과와 일치하게, CD3/28 비즈로 활성화된 T 세포는 TransAct로 활성화된 세포보다 CD8+ T 세포의 빈도가 약간 높았습니다. 표현형 분석에서는 기증자 의존적 변이가 크기 때문에 대표성 공여자 한 명이 나타난다(그림 5E). 활성화 시약과 CD4/CD8 상태 모두 T 세포 표현형에 영향을 미치지만, CAR 발현은 MOCK transfected 세포와 비교해 표현형 변화를 일으키지 않습니다.
mRNA 농도가 발현 수준에 미치는 영향을 평가하기 위해, 1차 T 세포에 돌연변이 GFP(muGFP)를 암호화하는 mRNA를 0.1, 0.3, 1, 3 또는 6 μg의 mRNA로 형질전환했습니다. GFP 신호는 전기천공 후 24시간 후 유세포검사로 측정되었습니다. 예상대로, 이미 0.1 μg만큼 mRNA가 적은 상태에서도 검출 가능한 GFP 신호가 나타났으며, mRNA 양이 증가할수록 신호 강도도 점차 증가했습니다. 우리 실험에서 1 μg의 mRNA는 이미 포화 상태였으며, 더 많은 양(3 및 6 μg)은 GFP 신호 증가로 이어지지 않았습니다(그림 5F). 이는 발현 수준을 조절하기 위해 다양한 mRNA를 사용할 수 있는 가능성을 강조하며, 이는 다양한 CAR- 또는 표적 항원 발현 수준 검사에 유익할 수 있습니다28.
<img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 5"> 
그림 5: CAR의 발현 동역학 및 형질전환된 CAR T 세포의 표현형 분석. (A) CAR-인코딩 mRNA를 이용한 전기천공 후 CAR T 세포의 생존 가능성. 10분 인큐베이션 후 생존 가능성을 평가하기 위해 7-AAD 2 μL 염색 버퍼 100 μL 투여를 수행하였다. n = 2-3명의 개별 기증자 (B) 항-DYKDDDDK 항체(APC와 결합, 최종 희석 1:50)로 CAR 발현 염색. 생존 세포에 게이팅한 후, MOCK-transfected 대조군 대비 CAR 양성 세포의 비율(왼쪽 패널) 또는 전체 집단의 기하학적 중앙 형광 강도(GeoMean, 오른쪽 패널)를 분석하였다. 여기 S.D. (C) 대표성 점 플롯 ± n = 3명의 개별 기증자의 평균을 보여드리며, CAR 발현의 시간에 따른 동역학을 보여줍니다. (D) CD4+/CD8+ T 세포 분석 및 전기천공 후 24시간 후 MOCK-transfected와 CAR-transfected T 세포 및 두 가지 다른 활성화 전략 비교. 이는 전기천공 후 24시간 이내에 나타난 S.D. (E) MOCK-transfected 및 CAR-transfected T 세포의 표현형 분석에서 n=3명의 개별 기증±자의 평균을 보여줍니다. n=3의 대표 기증자 한 명을 보여준다. (F) 전기천공 후 24시간 후 다양한 mRNA 양의 muGFP 발현 분석. GFP의 지오평균 정량화가 이루어지기 전에 생세포의 게이팅이 수행되었습니다. 여기 S.D. 약어로 n=3명의 기증자의 평균± 표시되어 있습니다; CAR = 키메라 항원 수용체; mRNA = 메신저 리보핵산; 7-AAD = 7-아미노액티노마이신; RT = 실온; muGFP = 돌연변이 녹색 형광 단백질; S.D. = 표준편차. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>

1차 인간 T 세포의 분리, 배양 및 일시적 형질인화를 통해 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 방법

To assess the efficacy and potency of chimeric antigen receptor (CAR) T cells, it is essential to isolate, activate, expand, characterize, and genetically ...

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