쥐 해마에서 입증된 두꺼운 조직을 위한 냉동 전자 단층촬영 워크플로우
2026년 3월 27일
이 프로토콜은 고압 냉동(HPF)과 와플 방법, 극저온 집중 이온 빔(cryo-FIB) 리프트아웃, 선량 대칭 병렬 채취를 통합하여 두꺼운 조직에 대한 냉동 전자 단층촬영(cryo-ET)을 표준화하여, 쥐 해마에서 재 현 가능한 현장 분석을 위한 균일하게 얇은 층상과 유리화 표본을 제공합니다.
저의 연구는 쥐 해마와 같은 두꺼운 조직의 현장 구조 분석을 가능하게 하는 표준화된 냉동 에너지 외계 워크플로우를 구축하는 데 중점을 두고 있습니다. 기존 방법은 두꺼운 조직에 대한 신뢰성이 부족하기 때문에, 이 프로토콜은 표준화된 분석을 위한 최적화된 단계를 통합합니다. 우선, 깨끗한 유리 표면에 10% 자당 용액 10L 방울을 놓으세요.
최근에 안락사한 쥐의 해마를 신속히 해부하세요. 날카로운 면도날을 사용해 0.5에서 1 입방밀리미터 크기의 작은 조직 조각을 절제합니다. 이쑤시개나 가는 솔을 사용해 조직을 고압 냉동 운반체 내 준비된 구리 지지 TEM 격자에 옮깁니다.
2-메틸펜테인을 사용해 조직을 촉촉하게 유지하고 그리드 내 위치를 조정하며, 기계적 스트레스를 최소화하여 그리드 손상을 방지하세요. 그 다음, 조직과 격자를 3밀리미터 직경의 구리 호일 디스크로 덮습니다. 조립을 완성하려면 두 번째 고압 냉동 캐리어를 평평한 면으로 아래로 올려 밀봉된 와플 샌드위치를 만듭니다.
그리고 기구에 이상이 없는지 얼리는 파라미터도 확인하세요. 조직 해부부터 냉동까지의 총 시간이 90초를 넘지 않도록 하세요. 리프트아웃 절차의 최종 수신자 그리드로 사용할 새로운 300메시 골드 그리드를 확보하세요.
실온에서 입체 현미경 아래, 그리드를 부드럽게 호환되는 크라이오-FIB 오토그리드 링에 클립으로 끼워 넣으세요. 그 후 조립된 오토그리드를 약 40도 섭씨로 유지한 건조 오븐에 직접 보관하여 사용 전 서리 축적을 최소화합니다. 조립체를 액체 질소에 지속적으로 담그는 동안, 유리화된 TEM 그리드를 주변 와플 조립 부품과 조심스럽게 분리합니다.
미리 냉각된 미세 핀셋을 사용해 두 개의 고압 냉동 캐리어를 부드럽게 분리합니다. 다음으로, 미리 냉각된 냉동 로딩 작업대에서 분리된 조직 그리드를 액체 질소 보호 하에 두 번째 크라이오-FIB 오토그리드 링에 장착합니다. 두 개의 오토그리드를 냉동 전송 셔틀 샘플 홀더의 지정된 슬롯에 장착하세요.
각 오토그리드의 방향을 조정하여 밀링 노치가 바깥쪽을 향하고 수직으로 배치되도록 하여 밀링 각도를 낮출 수 있게 하세요. 완전 적재된 셔틀은 액체 질소에 담그거나 사전 냉각 상태로 유지하다가 FIB-SEM으로 옮겨집니다. 샘플 로드를 사용해 샘플 스테이지를 기기에 적재합니다.
냉동 전송 후 현미경으로 이동하면 저해상도 SEM 확대로 조직 그리드로 이동합니다. 그 후 30밀리암페어 압력으로 15초간 플래티넘을 스퍼터 코팅하여 전도성 보호를 제공합니다. 가스 주입 시스템을 사용하여 약 60초간 두께 0.5에서 1.0마이크로미터 두께의 유기금속성 백금 캡을 매장합니다.
30밀리암페어에서 15초간 격자 표면에 최종 스퍼터 코팅된 백금 층을 바릅니다. SEM 전자빔 이미지를 사용해 조직 격자에서 선택한 관심 영역으로 이동합니다. 전면 밀링을 위해 시료의 방향을 맞추기 위해, 이온 빔 접근에 적합한 각도로 시료 표면을 제시하기 위해 스테이지를 약 110도 회전, 7도 기울이도록 조정하세요.
트렌치 밀링의 경우, 30킬로볼트에서 작동하는 이온 빔을 사용하여 목표 조직 블록을 둘러싼 직사각형 트렌치를 정의합니다. 블록에서 떨어진 곳에서 15나노암페어의 비교적 높은 전류를 사용해 밀링을 시작하여 빠른 재료 제거를 달성합니다. 트렌치 벽이 블록에 몇 마이크로미터 이내로 가까워질수록 이온 빔 전류를 7나노암페어로 줄여 더 정밀한 밀링 제어를 달성합니다.
블록의 한쪽 면을 벌크 자재에 붙여 임시 고정 탭을 만드세요. 두께가 20마이크로미터를 초과하는 조직 블록의 경우, 최종 리프트를 용이하게 하기 위해 반대면에서 언더컷 밀링 단계를 수행하세요. 스테이지를 돌리고 기울기를 조절해 블록 바닥에 닿게 하세요.
30킬로볼트와 3나노암페어 전류의 집중 이온 빔을 사용해 하단 연결을 밀링합니다. 금속 블록 바닥을 샘플 블록에 밀착시키세요. 시료와 금 블록 사이의 접촉면을 정밀 밀링하여 접촉을 더 단단하게 만듭니다.
샘플을 바늘에 부착할 때는 금 블록이 목표 샘플과 직접 접촉하도록 해야 합니다. 30킬로볼트와 0.5나노암페어의 집중 이온 빔을 사용해 인터페이스에서 8에서 12회의 연속 단면적 밀링 패턴을 수행하여 금 블록을 시료에 용접합니다. 조직 블록을 들어 올리려면, 집중 이온 빔을 이용해 블록과 벌크 샘플을 연결하는 남은 탭을 절단합니다.
마이크로매니퓰레이터 바늘을 조심스럽게 조작해 고립된 조직 블록을 도랑과 주변 격자에서 완전히 분리시킵니다. 바늘을 당기고 블록을 수신기 그리드로 옮깁니다. 마이크로매니퓰레이터 바늘을 이용해 미리 냉각된 300메시 골드 수신자 그리드로 이동하세요.
블록을 선택한 격자 칸 위에 내려놓습니다. 조직 블록과 그리드가 더 단단히 붙도록 그리드의 작은 얼음 결정들을 밀어내세요. 조직 블록을 낮춰서 그리드에 닿게 하세요.
블록에서 이온 빔을 이용해 3에서 4마이크로미터 두께의 슬라이스를 격자 필름에 밀링합니다. 다음으로, 접합부 양쪽에 세척 단면 패턴을 사용하여 밀링하여 슬라이스를 단단히 용접하고, 앞서 보여준 대로 전도성 및 보호 코팅을 그리드 표면에 다시 적용합니다. 라멜라 얇아짐을 위해서는 스테이지 틸트를 설정한 후 조직 블록의 매끄러운 영역 내에서 최종 라멜라 위치를 정의합니다.
제시된 표에 명시된 이온 빔 전류와 과다 기울기 보상을 사용하여 체계적인 밀링을 수행합니다. 라멜라에서 1에서 2마이크로미터 이내일 때는 선택적으로 약 1.5마이크로미터 떨어진 곳에 응력 완화 트렌치를 밀링하여 라멜라의 휘거나 말리는 것을 방지할 수 있습니다. 라멜라 준비 후에는 냉동전자현미경으로 이미지를 획득합니다.
와플 방식으로 고압 냉동을 처리한 조직 블록은 균일하고 전자가 투명한 모습을 보였다. 재구성된 단층촬영술은 세포 환경 내 미토콘드리아 구조를 해명했습니다. 리보솜과 같은 고분자 복합체는 세포질 내에서 명확히 해소되었습니다.
재구성된 단층촬영술에서는 세포골격 및 막 관련 세포 특징과 핵 복합체도 관찰되었습니다. 단층촬영술에서 칼슘 저장과 미엘린 피 구조 등 시냅스 구조와 특징이 명확히 관찰되었습니다. 이 프로토콜은 연구자들이 복잡한 조직 환경 내에서 토착 세포 외부 구조를 직접 연구할 수 있게 합니다.
이 냉동 ET 프로토콜에서 가장 중요한 과제는 두꺼운 조직 샘플의 균일하고 인위물 없는 유리화를 달성하는 것입니다. 이 절차 후, 연구자들은 상관광과 전자현미경 또는 라벨링 기법을 이용해 관심 영역을 위치시키고, 그 후 아단층촬영 평균화와 구조 분석을 수행하여 고분자 복합체를 해독할 수 있습니다.
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Overview
This article presents a comprehensive, standardized workflow for cryo-electron tomography (cryo-ET) of thick tissue samples, specifically demonstrated on mouse hippocampus. The protocol integrates rapid high-pressure freezing, precise cryo-focused ion beam (cryo-FIB) milling, and advanced imaging and data processing steps to enable high-resolution, in situ structural analysis of native cellular environments within complex tissues.
Key Study Components
Area of Science
- Structural biology
- Cryo-electron microscopy
- Tissue ultrastructure analysis
Background
- Cryo-ET allows 3D visualization of cellular ultrastructure in a near-native state.
- Application to thick tissues is limited by challenges in vitrification and lamella preparation.
- Existing protocols often lack reproducibility and throughput for complex tissue samples.
- Reliable workflows are needed for in situ analysis of macromolecular complexes within tissues.
Purpose of Study
- To establish a reproducible, end-to-end cryo-ET workflow for thick tissue samples.
- To optimize vitrification and lamella preparation for high-quality imaging.
- To enable high-throughput, artifact-free structural analysis of native tissue environments.
Methods Used
- Rapid dissection and high-pressure freezing (HPF) of tissue using a "waffle" assembly with copper foil.
- Transfer and mounting of tissue onto TEM grids, followed by vitrification within 90 seconds of dissection.
- Cryo-FIB milling for lift-out and thinning of tissue blocks to 120–200 nm lamellae, with over-tilt compensation and stress-relief trenching.
- Standardized conductive coating using sputter platinum and gas injection system (GIS) platinum cap.
- Automated, dose-symmetric tilt-series acquisition using PACEtomo scripts.
- Data processing with AreTomo 3 for motion correction, CTF estimation, alignment, and WBP reconstruction; optional IsoNet for missing-wedge correction.
- Subtomogram averaging and resolution assessment using RELION 4.0.
Main Results
- The workflow consistently produces well-vitrified, uniform lamellae (target thickness 150 ± 40 nm).
- High-throughput tilt-series collection is achieved (typically 5–8 minutes per tilt series).
- Reconstructed tomograms resolve key cellular structures, including mitochondria, ribosomes, cytoskeletal elements, nuclear pore complexes, synaptic features, calcium stores, and myelin sheaths.
- The protocol enables direct visualization and analysis of macromolecular complexes in situ within thick tissue samples.
Conclusions
- This standardized protocol overcomes major challenges in cryo-ET of thick tissues, particularly vitrification and lamella preparation.
- It provides a reproducible, high-throughput route for in situ structural biology studies in complex tissue environments.
- The workflow facilitates detailed analysis of native cellular architecture and macromolecular assemblies directly from tissue.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
High-resolution, in situ structural analysis of thick tissue samples is a critical bottleneck in early discovery and translational research. This standardized cryo-electron tomography (cryo-ET) workflow enables reproducible, artifact-minimized visualization of native cellular architecture directly from complex tissues, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The protocol's throughput and reliability position it as a foundational capability for enterprise-scale structural biology and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of macromolecular complexes within native tissue environments.
- Supports mechanistic de-risking by resolving cellular ultrastructure relevant to disease pathways.
- Facilitates functional target validation through high-fidelity visualization of subcellular features.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by minimizing sample preparation artifacts.
Screening & Assay Development
- Prepares uniform, electron-transparent lamellae suitable for downstream high-throughput imaging workflows.
- Standardizes sample preparation to ensure reproducibility and quantitative comparability across experiments.
- Enables reliable assessment of compound effects on tissue ultrastructure in screening campaigns.
- Supports platform scalability and reuse for diverse tissue types with minimal adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural readouts with disease-relevant tissue models for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical validation in complex tissues.
- Reduces risk of late-stage biological failure by enabling early detection of ultrastructural phenotypes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on direct visualization of target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling robust, high-throughput structural analysis of thick tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct visualization of native macromolecular assemblies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative lamellae preparation for reliable downstream imaging and analysis.
- Analytics: Provides high-resolution tomograms and subtomogram averages for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease-relevant model validation using in situ tissue architecture.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized protocol adaptable across tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable sample preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM, cryo-FIB milling, and high-pressure freezing instrumentation.
- Demands access to advanced analytical infrastructure for automated tilt-series acquisition and data processing.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, vitrification, and lamella preparation protocols.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of dissection and freezing parameters.
- Uniform vitrification and artifact minimization are critical for reproducible, high-quality outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
High-Pressure Freezing of Thick Tissue for Cryo-Electron Tomography
1:44
Preparation of Receiver and Tissue Grids for Cryo-FIB Lift-Out
4:08
Tissue Block Isolation and Lift-Out
6:56
Block Attachment to the Receiver Grid
7:49
Lamella Thinning
8:36
Results
9:23
Conclusion
