나노포어 시퀀싱 기반 워크플로우를 이용한 롱리드 플라스미드 시퀀싱 및 조립
July 7th, 2026
본 연구는 염색체 서열이 이미 알려져 있거나 관심 없는 플라스미드의 나노포어 시퀀싱 워크플로우를 설명합니다. 초기 플라스미드 DNA 풍부화 단계는 최적의 플라스미드 서열 깊이를 보장하고 플로우 셀당 시퀀싱 가능한 샘플 수를 극대화합니다.
우리는 자기복제 원형 DNA 요소, 즉 플라스미드의 복제, 유지 및 확산을 조사하고 있으며, 이는 플라스미드의 서열 결정을 필요로 합니다. 이 프로토콜은 긴 읽기 시퀀싱과 관련된 커버리지 및 정확성 문제를 해결하기 위해 플라스미드 DNA를 농축하고 어셈블리 방법을 최적화합니다. 우리의 프로토콜은 염색체 서열이 알려져 있거나 무관한 상황에서 플라스미드를 시퀀싱하도록 설계되었습니다.
시작하려면 적절한 항생제가 첨가된 LB 오거 플레이트에 시료를 줄무늬로 놓습니다. 이는 해당 플라스미드 보유 내성 마커를 선택하기 위함입니다. 37도 섭씨에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 다음 날, 적절한 항생제가 첨가된 LB 배지 3~5밀리리터에 단일 분리된 군집을 접종합니다.
배양액을 37도 섭씨에서 약 8시간 동안 흔들어 배양하거나 600나노미터에서 광학 밀도가 1~2에 도달할 때까지 배양합니다. 그런 다음 시작 배양액 400마이크로리터로 적절한 항생제가 첨가된 400밀리리터의 LB 배지를 접종하고 앞서 설명된 대로 배양합니다. 그런 다음 배양액을 배양 부피에 맞는 원심분리기 병으로 옮깁니다.
4,200 G에서 10분 동안 원심분리하고 제조사의 권장 시약량을 사용하여 펠렛을 재현합니다. 세포 용해 및 중화 후, 4,200 G에서 30분 동안 용해액을 원심분리합니다. 상청을 새로운 튜브로 옮기고 다시 원심분리합니다.
제조사의 지침에 따라 평형화, 세척 및 DNA 용출을 수행합니다. 그런 다음 용착된 DNA를 100마이크로리터의 핵산분해효소가 없는 물로 재현하여 나노 포어 도서관 준비를 위해 농도를 극대화합니다. 다음으로 DNA를 정량하기 위해 표시된 표에 따라 분석 튜브를 준비합니다.
형광계를 보정한 후 시료 튜브를 형광계에 삽입하고 기기 설명서에 따라 판독값을 기록합니다. 열 주기기를 30도 섭씨에서 2분 동안, 그 다음 80도 섭씨에서 2분 동안 프로그래밍합니다. 해동된 키트 구성품을 표시된 표에 따라 회전하고 혼합합니다.
열 주기기 프로그램을 사용하여 바코딩을 위해 준비된 PCR 튜브를 배양합니다. 그런 다음 튜브를 얼음에 넣어 식힙니다. 바코드 처리된 샘플을 깨끗한 1.5밀리리터 엡펜도르프 튜브에 풀어 총 부피가 1,000마이크로리터를 초과하지 않도록 합니다.
비드를 진동시킨 후 바코드 처리된 풀에 동일한 부피의 비드를 추가합니다. 튜브를 플릭하여 혼합하고 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 자석에 놓고 80%에탄올 1밀리리터로 비드를 세척합니다.
에탄올을 제거하고 한 번 더 반복합니다. 튜브를 자석에서 제거합니다. 처리된 바코드 수에 따라 적절한 부피를 사용하여 용출 버퍼에 비드를 재현하고 상온에서 10분 동안 배양합니다.
용출된 시료의 1마이크로리터를 사용하여 형광계에서 DNA 농도를 정량하여 성공적인 도서관 준비를 확인합니다. 어댑터 접합을 위해 DNA 도서관의 11마이크로리터를 새로운 튜브로 옮기고 라벨을 지정합니다. 그런 다음 해동된 빠른 어댑터를 희석하기 위해 표시된 구성품을 신선한 튜브에 혼합합니다.
다음으로 11마이크로리터의 DNA 도서관에 빠른 어댑터를 1마이크로리터 첨가하고 튜브를 플릭하여 내용물을 혼합합니다. 튜브를 짧게 회전하여 전체 부피가 바닥에 모이도록 하고 벤치에서 5분 동안 튜브를 배양합니다. 신선한 DNA 튜브에 플로우 셀 프라이밍 믹스를 준비하고 역
Overview
This article presents a detailed workflow for nanopore sequencing aimed at maximizing plasmid DNA yield and sequencing accuracy. The protocol encompasses plasmid extraction, rapid barcoding, adapter ligation, sequencing, and sequence assembly, and is suitable for a wide range of plasmid sizes and levels of chromosomal contamination. The method is demonstrated using Escherichia coli as a model organism.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- Genomics
- Microbiology
Background
- Plasmid sequencing is essential for genetic studies, recombinant gene expression, and plasmid capture experiments.
- Traditional sequencing methods may be limited by chromosomal contamination and low plasmid yield.
- Nanopore sequencing offers long-read capabilities and real-time data acquisition.
- Efficient workflows are needed to optimize plasmid sequencing throughput and accuracy.
Purpose of Study
- To develop and describe a robust workflow for nanopore-based plasmid sequencing.
- To maximize plasmid DNA yield and sequencing accuracy.
- To enable efficient parallel sequencing of multiple samples.
Methods Used
- Plasmid DNA extraction from clinical E. coli strains.
- Library preparation using rapid barcoding and adapter ligation.
- Loading libraries onto a nanopore flow cell for sequencing.
- Base calling performed in real time or post-hoc.
- Sequence assembly using Autocycler.
- Comparison of assemblies to gel mobility and short-read polished assemblies.
Main Results
- Plasmid assemblies matched sizes inferred from gel mobility.
- In two-thirds of cases, assemblies matched or closely resembled short-read polished assemblies (within 0.05% pairwise identity).
- Protocol supports plasmids from 4 to 174 kb in size.
- Up to 72% chromosomal contamination tolerated without loss of accuracy.
- Parallel sequencing of up to 24 samples achieved with optimal coverage.
Conclusions
- The workflow enables accurate and efficient plasmid sequencing using nanopore technology.
- It is suitable for plasmid verification, improving WGS-derived plasmid sequences, and sequencing plasmids captured by conjugation.
- The protocol is robust to chromosomal contamination and applicable to a range of plasmid sizes.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Long-read nanopore plasmid sequencing enables high-confidence verification and assembly of plasmid constructs, supporting critical quality control and mechanistic de-risking in biopharma R&D. This workflow addresses the challenge of chromosomal contamination and variable plasmid yield, providing robust, scalable solutions for recombinant DNA and gene therapy vector development. Its parallelization and tolerance for mixed DNA inputs streamline early discovery and preclinical workflows, enhancing portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of engineered plasmids for functional studies and target validation.
- Reduces ambiguity in construct identity, supporting mechanistic de-risking in discovery biology.
- Facilitates rapid triage of candidate constructs for downstream screening or expression.
Screening & Assay Development
- Provides validated sequence data for assay-ready plasmids, ensuring reproducibility in screening campaigns.
- Supports parallel sequencing of up to 24 samples, increasing throughput for construct libraries.
- Delivers quantitative sequence accuracy, enabling reliable comparison across engineered variants.
Translational & Preclinical Research
- Improves continuity from discovery to preclinical studies by confirming plasmid integrity in disease-relevant systems.
- Enables sequence verification for plasmids used in gene delivery or biomarker studies.
- Supports risk-adjusted advancement by minimizing sequence-related uncertainties in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanopore-based workflow integrates from early construct verification through screening and preclinical validation, supporting both hypothesis-driven and translational research pipelines.
- Discovery Biology: Confirms plasmid sequence fidelity, reducing risk of off-target effects in functional assays.
- Screening: Ensures assay-ready constructs are sequence-verified, supporting reproducible compound evaluation.
- Analytics: Provides high-accuracy, quantitative sequence data for cross-sample comparison and quality control.
- Translational Research: Aligns plasmid sequence verification with preclinical model requirements for gene expression studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, parallelizable sequencing capability adaptable across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in construct-driven studies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes plasmid verification, tolerates high chromosomal contamination, and supports high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by ensuring construct integrity before downstream investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plasmid extraction, library preparation, and nanopore sequencing workflows.
- Demands computational infrastructure scaled to real-time or post-hoc basecalling needs.
- Benefits from standardized protocols for cross-team reproducibility and data comparability.
- Adaptable to a range of plasmid sizes and host backgrounds, including high chromosomal DNA content.
- Best suited for applications where chromosomal sequence is known or not required.
