나노포어 시퀀싱 기반 워크플로우를 이용한 롱리드 플라스미드 시퀀싱 및 조립

우리는 플라스미드로 알려진 자가 복제 원형 DNA 원소의 복제, 유지 및 확산을 조사하며, 이를 통해 이들의 서열 규명이 필요합니다. 이 프로토콜은 플라스미드 DNA 농축과 조립 방법을 최적화하여 장독 시퀀싱과 관련된 커버리지 및 정확도 문제를 해결합니다. 저희 프로토콜은 염색체 서열이 알려져 있거나 관련 없는 상황에서 플라스미드를 시퀀싱하도록 설계되었습니다.

우선, 적절한 항생제를 첨가한 LB 오거 플레이트에 샘플을 스트릭하여 해당 플라스미드 내성 마커를 선택합니다. 플레이트를 37도 섭씨에서 24시간 부양하세요. 다음 날, 단일 분리된 콜로니에 적절한 항생제를 보충한 LB 배지를 3에서 5밀리리터 접종합니다.

배양물을 37도 섭씨에서 약 8시간 또는 600나노미터에서 광학 밀도가 1에서 2에 도달할 때까지 배양합니다. 그 후 적절한 항생제를 보충한 LB 배지 400밀리리터에 스타터 배양액 400마이크로리터를 접종한 뒤, 앞서 보여준 대로 배양합니다. 그 후 배양물을 배양 부피에 맞는 원심분리기 병에 옮깁니다.

4,200G에서 원심분리기를 10분간 가리킨 후 제조사에서 권장하는 시약 용량으로 펠릿을 재현탁합니다. 세포 용해 및 중화 후, 용해액을 4,200G에서 30분간 원심분리합니다. 상원액을 새 튜브로 옮기고 다시 원심분리합니다.

제조사의 지침에 따라 평형, 세척, DNA 용출을 수행하세요. 그 후 침전된 DNA를 100마이크로리터의 뉴클레아제 무첨가물에 재현탁하여 나노포어 라이브러리 준비를 위한 농도를 극대화합니다. 다음으로, DNA를 정량하기 위해 제시된 표에 따라 분석관을 준비합니다.

형광도계를 교정한 후, 시료 튜브를 형광도계에 삽입하고 기기 설명서에 따라 측정값을 기록합니다. 열 사이클러를 30도 섭씨로 2분간 프로그래밍한 뒤, 80도 섭씨로 2분간 설정하세요. 제시된 표에 따라 해동된 키트 부품을 돌려 섞으세요.

열 사이클러 프로그램을 사용해 바코딩을 위해 준비한 PCR 튜브를 인큐베이팅합니다. 그 다음 튜브를 얼음 위에 올려 식히세요. 바코드 샘플을 깨끗한 1.5밀리리터 에펜도르프 튜브에 모아 총 부피가 1,000마이크로리터를 넘지 않도록 합니다.

비즈가 소용돌이가 되면, 모인 바코드 샘플에 같은 부피의 비즈를 추가합니다. 튜브를 튕기며 섞고, 10분간 부화시킵니다. 그 후 자석 위에 80% 에탄올 1밀리리터로 비즈를 세척하세요.

에탄올을 제거하고 한 번 반복하세요. 자석에서 튜브를 분리하세요. 사용 중인 바코드 수에 맞는 부피로 용출 버퍼에 다시 현탁한 후 상온에서 10분간 배양합니다.

형광광도계에서 채취한 샘플의 1마이크로리터를 사용해 DNA 농도를 정량하여 라이브러리 준비가 성공했는지 확인한다. 어댑터 연결을 위해서는 DNA 라이브러리 11마이크로리터를 새로운 튜브에 옮기고 라벨링합니다. 그 다음 제시된 부품들을 신선한 튜브에 섞어 해동한 급속 어댑터를 희석합니다.

다음으로, 희석된 신속 어댑터 1마이크로리터를 DNA 라이브러리 11마이크로리터에 넣고 튜브를 튕겨 내용물을 섞습니다. 튜브를 잠시 돌려 전체 부피가 바닥에 모이도록 하고, 튜브를 벤치 위에서 5분간 보관하세요. 유동 셀 프라이밍 혼합물을 신선한 DNA 튜브에 넣고 역전과 피펫팅으로 혼합합니다.

장치의 뚜껑을 들어 올려 플로우셀을 부드럽게 압력을 가하며 올바른 위치에 삽입하세요. 프라이밍 포트 안팎에 공기 방울이 있는지 확인한 후, 20에서 30마이크로리터의 액체를 빼내어 기포를 제거하세요. 그 후 800마이크로리터의 프라이밍 혼합물을 끌어올려 기포를 피하며 프라이밍 포트에 분배하고 장치를 5분간 방치하세요.

여기 제시된 대로 DNA 라이브러리와 적절한 부피의 라이브러리 비즈를 섞어 새 튜브에 넣으세요. 플로우셀 프라이밍 포트에 200마이크로리터의 프라이밍 혼합물을 주입하세요. 샘플 포트 커버를 조절해 포트를 드러내세요.

DNA 라이브러리 75마이크로리터와 비즈를 샘플 포트에 한 방울씩 투여하며, 각 방울이 흡수될 때까지 기다렸다가 다음 방울을 추가합니다. 그 다음 샘플 포트 커버를 다시 붙이고 프라이밍 포트를 닫으세요. 장치 뚜껑이 닫히면 시퀀싱 실행을 시작하세요.

멀티플렉싱되는 플라스미드 수를 기준으로 실행 시간 제한을 설정하며, 기본값은 48시간, 최대 72시간입니다. 초정확한 기본 통화 모드와 적절한 빠른 바코드 키트 옵션을 선택하세요. 그 다음 원시 FAST5 또는 POD5 데이터를 선택하고 베이스 호출을 시작하세요.

후속 조립용 필터링된 FASTQ 파일을 생성하려면, Filtlong을 사용해 긴 리드를 다듬어 약 5-10%의 저품질 리드를 제거하면서 전체 수율의 약 90%를 유지합니다. 권장 설정에 따라 Autocycler를 사용해 서브샘플을 측정합니다. 각 읽기 서브셋을 Raven, Flye, Kanu, Miniasm, Myloasm, NECAT, Plassembler 및 기타 선정된 어셈블러를 사용해 조립하세요.

각 조립 그래프 파일을 붕대를 사용해 시각화하세요. 원형, 조립기 간 크기 일관성, 키메라 접합부의 증거를 평가합니다. 여러 어셈블러에서 지지가 부족한 선형 연합체를 제거하고, 일관된 크기 추정치를 가진 원형 연속체를 유지합니다.

주요 플라스미드가 원형화될 때 합의 생성 전에 소규모 지지되지 않은 연속체를 제거하세요. 수동 선별 후 합의 생성으로 진행하세요. 큐레이션된 어셈블리를 사용해 Autocycler를 사용해 합의 시퀀스를 생성하세요.

남은 Autocycler 명령을 실행하여 최종 합의 플라스미드 서열을 생성합니다. 마지막으로, Medaka로 긴 리드를 잘라내어 최종 조립을 다듬어 합의 정확도를 높이세요. 모든 접합 분석법은 트랜스콘커건트를 생성하여 기증자 내에 접합 플라스미드가 존재함을 확인했다.

조립된 플라스미드 서열의 크기는 펄스장 겔 전기영동 이동도를 기반으로 한 추정치와 일치하였다. 나노기공 시퀀싱은 분석된 모든 샘플에 대해 충분한 읽기 출력과 품질을 제공했습니다. 염색체 오염률은 72.1%에서 28.0% 사이였으며, 평균 46.9%였습니다. 균열 플라스미드 UPEC_271에 대한 펄스장 겔 전기영동 분석에서 약 145 킬로베이스 쌍의 플라스미드 밴드가 발견되었습니다.

트랜스콘가건트 중 하나의 DNA는 145킬로베이스와 동일한 서열을 보였다. 맥박장 겔 전기영동 분석을 통해 줄100913 약 70 및 110 킬로베이스 쌍의 두 플라스미드가 확인되었습니다. 나노포어 시퀀싱은 71,182염기쌍과 111,226염기쌍으로 구성된 두 개의 플라스미드 조립체를 확인했습니다.

가장 중요한 고려사항은 염색체 서열이 관심 있는지 여부입니다. 그렇다면 표준 전유전체 시퀀싱 프로토콜이 더 낫습니다. 우리 프로토콜의 확대된 범위는 이형질 연구의 문을 열어줍니다. 즉,

특정 집단 내 플라스미드 서열 변이.