대 장균 과 포유류 세포에서 유전 암호 확장을 통한 부위 특이적 라이신 락틸화

우리는 모방 및 효소 한계를 극복하기 위해 클로크/RS tRNA 시스템을 개발했으며, 이를 통해 정밀한 라이신 락틸화 도입을 통해 생물학적 연구를 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 종양 대사, 효소 기능 및 클로크 위치 연구에 적용할 수 있습니다. 우선, 대장균 DH10B 50마이크로리터의 화학적으로 적합한 세포를 각각 약 100나노그램의 원하는 플라스미드와 함께 공동 변환합니다. 변환 혼합물을 얼음 위에서 25분간 부양한 후, 42도 섭씨에서 45초간 열충격을 가합니다.

튜브를 3분간 얼음에 넣어. 루리아 베르타니 미디엄 350마이크로리터를 추가하고, 37도에서 분당 220회전으로 1시간 동안 튜브를 세게 흔듭니다. 이제 변형된 세포 배양물을 암피실린과 클로람페니콜을 보충한 루리아 베르타니 한천 플레이트에 발랐습니다.

플레이트를 37도 섭씨에서 12시간에서 16시간 동안 부양합니다. 그 다음 접시에서 단일 군집을 골라 4밀리리터 스타터 배양액을 접종하고 하룻밤 동안 배화합니다. 다음 날에는 암피실린과 클로람페니콜이 포함된 루리아 베르타니 배지 400밀리리터로 하룻밤 배양을 확장합니다.

분당 220회전, 섭씨 37도에서 배양물을 격렬하게 흔들어 600나노미터에서 광학 밀도가 0.6에서 0.8 사이에 도달할 때까지 합니다. 다음으로 0.2% L-아라비노스와 1밀리몰라 락틸 라이신을 유도하여 30도, 분당 220회전에서 16시간 배양합니다. 종자 셀은 12웰 플레이트 위에 1 곱하기 10의 5 셀의 제곱 곱 크기로 구성되며, 1밀리리터 DMEM을 사용합니다.

세포 합류율이 70%에서 80% 사이일 때까지 24시간 배큐팅한 후 형질전환으로 진행합니다. 희석된 DNA 용액을 준비하기 위해, sfGFP 리포터와 pNeu-KlacRS를 포함한 플라스미드 0.75마이크로그램을 1:1 비율로 38마이크로리터의 혈청 무첨가 DMEM에 고포도당 상태로 첨가합니다. 부드럽게 피펫을 위아래로 움직이거나 잠시 소용돌이로 섞어 주세요.

희석된 형질전환 시약을 준비하기 위해, 고포도당의 38마이크로리터 무혈청 DMEM에 2.25마이크로리터의 형질전환 시약을 첨가합니다. 피펫을 부드럽게 위아래로 세 번에서 네 번 정도 사용해 완전히 섞으세요. 희석된 형질전환 시약을 희석된 DNA 용액에 즉시 모두 첨가하세요.

이제 피펫을 위아래로 3번에서 4번 돌려 내용물을 혼합하고, 용액을 상온에서 10분에서 15분 정도 배양하여 형질전환과 DNA 복합체가 형성되도록 합니다. 각 웰에 50마이크로리터의 트랜스펙션 및 DNA 복합체를 각각 떨어뜨리고, 플레이트를 부드럽게 휘저어 혼합물을 균질화합니다. 형질전환 6시간 후에는 1밀리몰라 락틸 라이신이 포함된 신선한 DMEM으로 배양지를 교체하고 세포를 24시간에서 48시간 배양합니다.

대장균에서는 성장 배지에 밀리몰라 락틸 라이신 1개를 첨가하여 전장 hENO1-89Klac이 생성되었습니다. 면역블롯 검사를 통해 항-히스 태그와 항-L-락틸 라이신 항체를 사용하여 전장 hENO1-89Klac의 존재가 확인되었습니다. 비행질량분석법의 전기분무 이온화 시간은 48,178달톤에서 우세한 피크를 보여주었으며, 이는 메티오닌이 없는 hENO1-89Klac의 예상 질량과 일치한다.

삼면화 소화의 탠덤 질량분석법은 수정된 펩타이드에 매핑된 완전한 B&Y 이온 시리즈의 존재를 통해 잔기 89에서 Klac의 부위특이적 통합을 확인했습니다. 포유류 HEK293T세포에서는 클락을 24시간 및 48시간 동안 첨가했을 때 형광 현미경에서 세포 전반에 강한 sfGFP 발현이 관찰되었으나, 클락 보충 없이는 형광이 관찰되지 않았습니다. 유세포 검사 결과, 약 31%의 세포가 24시간 후 sfGFP를 발현하고, Klac 보조 후 48시간 후에는 약 37%로 증가하는 것으로 나타났습니다.

이 프로토콜은 단백질 기능에 대한 부위 특이적 라이신 락틸화 효과를 조사할 수 있게 하며, 결과적인 생물학적 및 기능적 결과 측정을 용이하게 합니다. 이 절차를 거쳐 연구자들은 기전적 연구를 수행하고, 고처리량 스크리닝 분석을 수행하며, 장기간 기능 분석을 위한 안정적인 세포주를 생성할 수 있습니다. 향후 연구는 효율성 향상, 안정적인 통합, 클럭 생합성 개발을 목표로 합니다.