경추 림프관 캐뉴럴 쥐 모델을 이용한 머리와 뇌로부터의 림프 수송 평가

우리 프로젝트는 뇌 림프관이 알츠하이머병, 뇌졸중, 신경염증과 같은 중추신경계 질환과 어떻게 연관되는지 조사하며, 뇌에서 배출되는 물질을 식별합니다. 기존 방법들은 이 프로토콜로 가능해진 CNS 유래 림프류 유출을 이론적으로 샘플링하고 정량화하는 프로토콜과 신뢰할 수 있는 접근법이 부족했습니다. 우선, 폴리에틸렌 캐뉼라 내부 표면을 코팅할 30게이지 바늘을 사용해 1밀리리터 무균 인슐린 주사기에 약 0.7밀리리터의 희석 항응고제 용액을 미리 투여합니다.

미리 충전된 주사기는 사용 전까지 멸균 상태에서 보관하세요. 캐뉼라를 준비할 때는 말단 구간에는 외경 0.5mm, 내경 0.3mm의 튜빙을, 중간 구간에는 외경 0.6mm, 내경 0.5mm의 튜빙을 사용합니다. 가위를 사용해 주사기 바늘에 연결된 근위 부분은 2센티미터, 중간 부분은 40센티미터, 관을 삽입할 예정인 원위 부분은 8센티미터 길이로 절단합니다.

캐뉼라를 머리부터 꼬리까지 정렬하세요. 그 후 캐뉼라 조립체의 원위 끝을 약 45도 각도로 절단하고 경사면을 만들어 경추 림프관에 부드럽게 삽입할 수 있도록 합니다. 각 캐뉼라의 개성 여부를 확인하려면 미리 장착된 주사기를 조립된 캐뉼라의 근위 끝에 연결하세요.

소량의 용액을 부드럽게 방출해 캐뉼라를 세척하세요. 용액이 원위부에서 누출 없이 원활하게 배출되도록 하세요. 마취된 쥐를 37도 섭씨로 유지된 가열된 수술용 패드 위에 눕히세요.

필요하다면 작은 지지 베개를 사용해 머리를 기울이고 목을 펴서 경추 부위의 노출을 늘리세요. 움직임을 최소화하기 위해 고무줄이나 수술용 테이프로 부드럽게 앞다리를 고정하세요. 면도를 돕기 위해 경추 부위의 털을 멸균 생리식염수로 씻어내세요.

절개 전에 수술 부위 전체를 완전히 털이 제거되도록 완전히 면도하세요. 수술 부위를 2.5센티미터 점선으로 표시하여 초기 절개 길이를 확인하세요. 절개 부위의 윗부분을 아래 입술에서 약 1에서 1.5센티미터 아래에 위치시킵니다.

발가락 꼬집기 반사로 마취 깊이를 확인한 후, 표시된 선을 따라 경추 근육의 얕은 층을 조심스럽게 절개합니다. 그 후 남은 근육층, 주로 표재성 경추근막을 부드럽게 분리하여 경추 동맥을 노출시킵니다. 흉선돌상근과 하악하선을 후퇴시키고, 경추 림프관 식별을 용이하게 하기 위해 수술 부위에서 멀리 기울이세요.

수술 창을 유지하기 위해 조직 확장기를 사용하세요. 면봉으로 림프절과 관련 림프관을 찾는 동안 근육 조직을 일시적으로 옆으로 잡아주세요. 경동맥과 평행하게 뻗은 불투명하고 무색의 경추 림프관을 찾아보세요.

둔탁한 겸자를 사용해 분리된 결합 조직을 부드럽게 통과시키고 겸자를 제자리에 유지합니다. 둔기 박리를 통해 경추 림프관을 주변 결합 및 지방 조직과 신중히 분리하세요. 그 다음 노출된 혈관 상반부에 작은 절개를 만듭니다.

수술 창문에서 약 1.5센티미터 떨어진 곳에 작은 2차 피부 천자를 만들어 캐뉼라의 추가 고정점 역할을 할 수 있습니다. 캐뉼라를 두 번째 구멍을 통해 삽입하고, 원위 끝을 겸자로 잡은 뒤, 경사면이 위쪽을 향하도록 하세요. 그 후 절개 부위를 약 2밀리미터 정도 림프관 안으로 부드럽게 삽입하여 머리 쪽으로 방향을 맞추세요.

캐뉼라의 근위부를 1분에서 2분간 관찰하세요. 림프액이 느리고 꾸준히 유출되는 것을 관찰하여 성공적인 캐닐레이션을 확인하세요. 절개 부위와 2차 고정 구멍에 피펫으로 시아노아크릴레이트 조직 접착제를 소량 발라하여 캐뉼라를 고정합니다.

림프류 현상을 몇 분간 관찰하여 안정적인 유출을 확인하세요. 그 후 조직 확장기를 조심스럽게 제거하고 하악하선을 원래 위치로 재배치합니다. 캐뉼라의 원위 끝에 미리 라벨이 붙은 항응고제 코팅 미세원심분리관을 부착하세요.

그 후 모든 근육층을 원래 위치로 다시 위치시키고, 피부 절개 부위를 봉합사나 조직 접착제로 봉합합니다. 림프를 항응고제 코팅된 미세원심분리관에 지속적으로 모아, 정해진 간격(보통 매시간 튜브)에 삽입합니다. 채취 기간 내내 쥐가 마취된 상태를 유지하도록 하세요.

수집한 샘플은 얼음찜질과 함께 쿨러 박스에 보관하세요. 성공적으로 캐논을 수 있는 쥐에서 6시간 동안 측정된 시간당 림프유량은 시간당 0.09에서 0.13밀리리터 사이였습니다. 건강한 쥐에서는 선조체 내 투여된 삼중수소 표지된 알부민의 누적 림프 운반은 처음 2시간 동안 무시할 만했으나 이후 크게 증가했다.

림프와 혈장 간 삼중수소 표지된 알부민 농도를 비교한 결과, 건강한 쥐에서 시간이 지남에 따라 서로 다른 농도 프로필이 나타났습니다. 대장균 지지다당의 복막 간 투여로 유발된 신경염증은 8시간 동안 전체 림프류 유량이 약간 감소하고 림프로 운반되는 총 용량 비율이 거의 두 배로 감소하는 것과 관련이 있었습니다. 림프-혈장 농도 비율은 건강한 쥐와 신경염증 쥐 간에 유의미한 차이가 없어 유사한 경추 림프관 클리어런스 프로필을 나타냈다.

이 프로토콜은 뇌 유래 림프의 직접 생물학적 샘플링을 가능하게 했으며, 간접 외부 영상 또는 수지 방법과 측정 가능한 중추신경계 유출을 연결했습니다. 이 프로토콜은 림프 경로를 통한 중앙 투여 약물 클리어링을 연구하여 배출 경로와 클리어율을 측정할 수 있게 합니다. 향후 연구들은 중추신경계 질환 상태가 림프 제거를 어떻게 감지하는지 조사하고, 이를 활용해 치료를 위한 뇌 림프 기능 회복을 위한 약물 최적화에 활용할 수 있습니다.