최소 입력으로 영아 면역 지도화: 통합 단세포 및 다종체 프로파일링

저희 연구는 소량의 혈액에서 시작한 종단 고차원 다중체 프로파일링을 통해 출생 후 초기 면역이 어떻게 적응하는지 정의합니다. 이 프로토콜은 건강, 감염, 염증 전반에 걸친 제한된 생체 표본을 대상으로 한 신생아 및 소아 종단 면역 프로파일링 연구에 적용할 수 있습니다. 먼저, 37도 수조에 녹인 용해된 영아 적혈구가 담긴 바이알을 빠르게 녹입니다.

해동된 세포를 15밀리리터 원뿔형 튜브에 10밀리리터의 따뜻한 완전 RPMI 배지, 37도 섭씨로 옮깁니다. 튜브를 400g 압력으로 실온에서 5분간 원심분리한 후 상원액을 버립니다. 세포 펠릿을 3밀리리터의 완전한 RPMI 배지에 다시 현탁하고 총 세포 수를 세어보세요.

농도가 너무 높아서 셀 수 없을 정도라면 샘플을 희석하세요. 세포 수를 세고 나서 원심분리 단계를 반복한 후 세포를 완전한 RPMI 배지에 다시 현탁하여 밀리리터당 100만 개의 세포 농도를 얻습니다. 96웰 V-바닥판의 각 웰에 100마이크로리터의 100만 개 세포를 옮깁니다.

플레이트를 764g 압력에서 4도 섭씨에서 2분간 원심분리합니다. 상원액은 버리세요. 다음으로, 1에서 2,000 마이크로리터 희석한 생죽은 염료 스톡 100마이크로리터를 PBS에 넣고, FC 블록과 단핵구 블록을 1에서 100으로 희석한 채 염색하지 않은 대조군을 제외한 모든 샘플에 첨가합니다.

샘플을 섭씨 4도에서 15분간 배양하세요. 세포를 세척하려면 PBS 100마이크로리터를 추가하세요. 플레이트를 764g 온도에서 4도 섭씨로 2분간 원심분리한 후 상청액을 조심스럽게 버리세요.

100마이크로리터의 표면 항체 혼합물을 형광 활성화 세포 분류(FACS 버퍼)로 희석한 상태로, 염색되지 않은 대조군을 제외한 모든 샘플에 첨가합니다. 섭씨 4도에서 30분간 배양하세요. 그 후 세포를 100마이크로리터 FACS 버퍼로 세척하고 원심분리한 후 상청액을 버립니다.

각 샘플에 4% 파라포름알데히드 100마이크로리터를 첨가하여 세포를 고정합니다. 실온에서 어두운 상태에서 15분간 배양한 후 다시 세포를 세척한 후 200마이크로리터의 FACS 버퍼에 재현탁합니다. UltraComp 보상 비즈를 단일 색상 컨트롤로 준비하세요.

샘플과 동일한 절차로 단일 색상 제어 비즈를 염색하며, 샘플이 고정되어 있다면 고정 작업도 포함합니다. 또한 형광 1 또는 FMO 대조군을 같은 방식으로 준비하세요. 샘플, 단색 대조군, 염색되지 않은 대조군, 형광-1 대조군을 일반 또는 스펙트럼 유세포계에 사용하세요.

FlowJo를 열고 분석할 관심 있는 샘플을 선택하세요. 적절한 아이소타입과 FMO 컨트롤로 게이트를 설정하세요. FSC와 SSC를 사용하여 잔해를 배제하고 세포 크기와 과립에 따라 선별하는 게이트 백혈구.

FSCA와 FSCH 중 더블렛은 제외합니다. 생존성 염료를 사용해 죽은 세포를 배제하는 게이트. 살아있는 단일 세포에서 CD33 음성 림프구와 CD-33 양성 골수세포로 분열합니다.

CD33 양성 세포 내에서 CD14 양성 단핵구를 식별합니다. 그 다음 CD33 양성 세포 내에서 CD14 음성, CD11C 양성 수지상 세포를 확인한다. 이제 CD33 음성 림프구 중에는 보행형 CD3 양성 T 세포와 CD3 음성 CD56 양성 자연 살해 세포가 있습니다.

CD3 양성 T 세포 내에서 CD8 양성 및 CD4 양성 소세포를 식별하고, CD3 음성, CD56 음성, CD19 양성 B 세포를 식별합니다. 먼저, 냉동 보존된 적혈구 용해세포 한 바이알을 37도 수욕에 녹여 해동합니다. 현탁액을 15밀리리터 원뿔형 튜브에 10밀리리터의 T세포 매체를 넣고, 430g 원심분리기를 4도 섭씨에서 5분간 보관합니다.

상원액은 버리세요. 세포 펠릿을 1밀리리터의 PBS로 재현탁한 후, 샘플에 추가로 9밀리리터의 PBS를 추가합니다. 튜브를 430g에서 4도 섭씨에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다.

트리판 블루 배제를 사용하여 세포 수를 세고 생존 가능성을 평가합니다. 생존 가능성이 70% 미만이라면 다음과 같이 죽은 세포 제거 키트를 사용하세요. 먼저, 멸균된 이중 증류수로 20배 결합 완충액을 희석하여 1배 결합 버퍼를 준비합니다.

세포 펠릿을 100마이크로리터의 죽은 세포 제거 마이크로비드에 재현탁하여 총 7개의 세포 제곱곱에 맞추세요. 잘 섞은 후 실온에서 15분간 배양하세요. 자기 분리 컬럼을 적절한 자기 스탠드에 넣고, 수집관도 함께 넣으세요.

그 후 500마이크로리터의 1x 결합 완충액으로 세척하여 컬럼을 평형으로 만듭니다. 세포 부유액을 500마이크로리터로 1배 결합 완충제로 늘리세요. 수집관을 교체한 후, 컬럼에 셀 현탁액을 적용하고 새로운 1.7밀리리터 마이크로 원심분리관에 흐름을 수집합니다.

다음으로, 컬럼을 500마이크로리터의 결합 버퍼로 두 번 세척한 후 같은 마이크로 원심분리관에 흐름을 모으세요. 300g에서 원심분리해 10분간 세척한 후 상원액을 버립니다. 트리판 블루 배제법을 사용해 세포 수를 세고 생존 가능성을 다시 평가합니다.

20,000개의 생존 가능한 세포를 새로운 1.7밀리리터 마이크로 원심분리관에 넣어. 그 후 세포를 300g에서 10분간 원심분리한 후 상원액을 제거하세요. 0.04%BSA를 포함한 PBS 40마이크로리터로 세포를 재현탁합니다.

마지막으로 세포가 담긴 튜브를 얼음 위에 올려놓고 즉시 유전체 코어 시설로 보내 라이브러리 생성과 서열 분석에 참여합니다. 셀 레인저 출력 형식으로 시퀀싱 결과를 수집하세요. 조산아와 대조군의 건조 혈점 샘플을 처리하였습니다.

그리고 92개의 면역 관련 단백질의 정규화된 단백질 발현이 정량화되었습니다. 2개월 조산아의 말초혈에서 림프구 활성화 유전자 3과 신호 전달 임계 조절 막 관통 어댑터 1의 발현이 만삭 제대혈에 비해 유의하게 높았다. 적혈구를 용해한 백혈구 샘플에서 백혈구 집단을 식별하기 위해 포괄적인 게이팅 전략이 사용되었습니다.

T세포 집단 내에서 CD4 양성과 CD8 양성 하위 집합이 구별되었다. 필터링 후 12만 개 이상의 세포가 포획되어 단일 세포 리보핵산 시퀀싱 데이터셋에 프로파일링되었습니다. 차원 축소 및 군집화 분석을 통해 14개의 뚜렷한 세포 군집이 확인되었습니다.

세포 클러스터는 차별적으로 발현된 유전자와 알려진 세포 표지자를 기반으로 주석을 달았습니다. 14개 클러스터 중 12개는 면역세포 계통에 해당하며, 여기에는 T 세포, 자연 살해 세포, B 세포, 골수종 세포, 호중구 등이 포함됩니다. 쌓인 막대 그래프는 1주, 1개월, 2개월 생 동안 군집당 세포의 상대적 비율을 보여주었습니다.

이 연구는 제한된 부피의 혈액 샘플에서 세포, 전사체, 단백질체, 기능성 면역 신호를 종단적으로 측정할 수 있게 합니다. 향후 연구들은 이러한 방법을 활용해 건강한 면역 궤적을 정의하고, 질병과 관련된 초기 생애 면역 반응 조절 장애를 밝혀낼 수 있습니다.