나노디스크 내 막 단백질 안정화 기법

이 프로토콜은 생성된 방법 프레임워크를 통해 재현 가능한 나노디스크 재구성 워크플로우를 강조합니다. 세제는 막 단백질을 불안정하게 만듭니다. MSP와 지질을 가진 나노디스크는 냉동 전자기와 용해를 위한 자연스러운 구조를 인지합니다.

먼저 클로로포름으로 조제한 지질 성분을 유리 시험관에 넣어 100마이크로리터 지질 혼합물을 만들고 완전히 섞어줍니다. 모든 액체가 제거될 때까지 부드러운 질소 가스 흐름 아래에서 클로로포름을 증발시킵니다. 약 2밀리리터의 n-펜테인을 유리 시험관에 드롭 방향으로 첨가한 후, 질소 가스를 사용해 용매를 증발시켜 건조하고 투명한 지질 막을 얻습니다.

튜브 캡을 풀고 진공 건조기에 넣으세요. 건조기를 진공 상태로 유지하여 잔류 용매를 제거하세요. 그 후 진공 건조기에서 지질 막을 제거하고, 세제 무첨가 저염 완충제 250마이크로리터를 추가해 지질 막을 수분 공급하여 최종 지질 농도는 10밀리그램/밀리리터로 만듭니다.

지질을 재현탁한 후에는 네 개의 유리관으로 고르게 나누세요. 서스펜션이 투명하고 투명해질 때까지 초음파 검사를 하여 성공적인 리포좀 형성을 나타냅니다. 그 후 즉시 각 튜브의 헤드스페이스를 질소 가스로 세척하고, 사용 전까지 영하 80도에서 보관하세요.

MSP1D1 플라스미드로 대장균 BL21 세포가 7-히스티딘 태그를 가진 후 배양 확장이 이루어졌습니다. 최종 농도인 0.5에서 1밀리몰에 IPTG를 첨가하여 MSP 발현을 유도합니다. 그 후 16도에서 16시간에서 20시간 동안 흔들면서 세포를 계속 배양합니다.

박테리아 배양물을 섭씨 4도에서 10분간 원심분리하세요. 상청액은 버리고 세포 펠릿은 남겨두세요. 그 후 1리터 배양액에서 추출한 펠릿을 100에서 150밀리리터의 용해 완충제에 재현탁합니다.

눈에 띄는 덩어리가 보이지 않는 균일한 현탁액이 될 때까지 철저히 균질화하세요. 다음으로, 냉장 초음파 세포 교란기를 사용해 3초 펄스 사이클과 6초 정지 사이클로 35% 파워로 박테리아를 파괴합니다. 분해액이 투명하고 연한 갈색이 될 때까지 초음파 검사를 계속하세요.

용해액을 30,000g 온도에서 4도 섭씨에서 45분간 원심분리하고, 이후 단계에 사용할 상상원액을 수집합니다. 상청액을 평형화된 니켈-NTA 수지와 함께 배양하고 불순물을 제거하기 위해 세척한 후, 용출 버퍼로 표적 단백질을 용출하고 용출물 분획을 수집합니다. 280나노미터에서 유루액의 흡수율이 0.01 이하로 떨어질 때까지 분획을 계속 수집합니다.

그 후 모인 유출액을 투석관에 옮기고, 4도 섭씨에서 투석 완충 상태에서 하룻밤 부드럽게 저으며 투석합니다. 투석 후에는 초여과 장치를 사용해 최종 MSP 농도를 2밀리리터에서 5밀리리터로 얻습니다. 약 250밀리그램의 바이오 비즈를 50밀리리터 원심분리관에 무게를 젬다.

튜브에 메탄올 25에서 30밀리리터를 추가하세요. 어두운 곳에서 혼합물을 철저히 회전시키거나 소용돌이로 돌리세요. 튜브를 4도 섭씨에서 20분간 배양한 후, 상청액을 조심스럽게 버리고 메탄올 세척을 두 번 더 반복합니다.

이중 증류수로 비슷한 세척을 세 번 수행한 후, 세제 무첨가 저염분 완충제를 25밀리리터에서 30밀리리터 사이에 첨가하세요. 앞서 보여준 것처럼 튜브를 회전 테이블 위에서 흔들거나 회전시켜 혼합하고 배양하세요. 상정액을 버리고 저염 완충 평형 과정을 세 번 반복하여 구슬을 완전히 컨디셔닝합니다.

활성화된 바이오 비즈를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브 3개로 균등하게 나누어 추가 사용을 마련합니다. 미리 준비된 지질 육수 한 알리코트를 꺼내 해동하세요. 즉시 7,000g에서 4도 섭씨로 5초간 원심분리하여 바닥의 내용물을 수집합니다.

지질 스톡을 60% 진폭으로 물에 초음파로 가열하고, 과열을 방지하기 위해 5분에서 10분마다 투명도와 온도를 모니터링하세요. 지질 성분이 투명하고 투명해질 때까지 초음파 검사를 계속하세요. 제시된 방정식을 사용하여 표적 막 단백질의 몰량을 계산합니다.

그 다음 목표 단백질과 MSP 대 지질의 1에서 5에서 250의 몰 화학양론 비율을 기준으로 필요한 MSP 및 지질 정액의 부피를 계산합니다. 해당 부피의 지질과 MSP를 합쳐 300마이크로리터 마스터 믹스를 준비하고 얼음 위에서 10분간 배양하세요. 그 후 혼합물을 50마이크로리터 정도 천천히 농축된 단백질 용액에 넣으면서 부드럽게 피펫팅하여 균질성을 확인합니다.

그 후 혼합물을 얼음에 1시간 동안 넣고, 15분마다 튜브를 부드럽게 뒤집어 완전히 섞으세요. 이제 미리 활성화된 바이오 비즈 한 알리코트를 취해 잔류 저염 완충제를 흡입하세요. 단백질 용액을 구슬에 넣고 어둠 속에서 4도 섭씨에서 1시간 동안 회전시키며 배양합니다.

혼합물을 7,000g에서 4도 섭씨에서 5초간 원심분리합니다. 상정액을 조심스럽게 두 번째 바이오 비즈 알리코트에 옮기고, 그 중 저염 완충제를 흡입했습니다. 부드럽게 반전하여 성분을 잘 섞은 후, 어둠 속에서 4시간에서 8시간 또는 하룻밤 동안 배양하세요.

단백질 용액을 잠시 원심분리한 후, 상청액을 세 번째 알리코트에 미리 활성화된 바이오 비즈로 옮깁니다. 어둠 속에서 섭씨 4도의 회전으로 1시간 동안 배양하세요. 짧은 원심분리 후 상원액을 깨끗한 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.

17,000g 원심분리기, 섭씨 4도에 10분간 원심분리기로 골재를 제거했습니다. 나노디스크 TASK2 복합체를 크기 배제 크로마토그래피로 정제한 후, 용출에서 나온 피크 분획을 모아 최종 나노디스크 TASK2 농도인 1.2에서 1.5 밀리리터당 농도로 농축합니다. 나노디스크 조립체를 검증하기 위해 12%SDS-PAG를 사용해 샘플을 분석하여 MSP와 표적 막 단백질의 존재를 확인합니다.

크기 배제 크로마토그래피 프로파일에서는 조립된 나노디스크 복합체에 해당하는 두 개의 주요 피크가 15.1밀리리터, 자유 MSP가 18.0밀리리터에 해당하는 두 개의 주요 피크를 나타냈습니다. 피크 면적의 정량화 결과, 조립된 나노디스크 피크의 면적은 147.2였다. 반면, 자유 MSP 피크는 면적이 31.5로 조립 효율 82.4%에 해당합니다. SDS-PAGE에서 표적 단백질과 MSP의 이동은 이들이 단일 나노디스크 복합체에 통합된 것을 확인했습니다.

이 프로토콜은 연구자들이 나노디스크 배열 구성을 이용해 막 단백질 구조를 연구하는 데 도움을 줍니다. 가장 어려운 부분은 막 단백질, MSP, 지질의 비율을 최적화하는 것입니다. 이 절차를 통해 기능적 분석, 표면 플라스몬 공명, 질량 분석도 수행할 수 있습니다.