자가 조립 인간 심장 세포에서의 저산소증-재산소화 손상 모델

저희 연구는 부상 후 심장 재생을 돕는 새로운 방법을 찾는 데 중점을 두고 있습니다. 이를 위해 자가 조립하는 심장 오가노이드를 생성하고 저산소 재산소화 연구를 수행합니다. 이 프로토콜은 부상 반응 연구, 재생 촉진을 위한 치료 개입, 그리고 환자별 질병 모델링에 적용될 수 있습니다.

우선, D1 심장 중배엽 명세균을 흡취하고, 인간이 유도한 다능성 줄기세포 유래 심장 중배엽 세포를 완전히 덮을 만큼 충분한 세포 박리 용액을 첨가합니다. 그 후 접시를 37도 섭씨에서 5분간 인큐베이터에 넣습니다. 피펫을 사용해 각 웰에 같은 부피의 D2 심장 중배엽 배지를 추가하고, 부드럽게 위아래로 피펫을 움직여 부착 세포를 방출하고, 세포 현탁액을 15밀리리터 원뿔관으로 옮깁니다.

원심분리기를 사용해 300G의 실온에서 3분간 세포를 펠릿으로 만듭니다. 펠릿을 5마이크로몰라 IWP-2와 RB-마이너스 아스코르빈산 50마이크로그램/밀리리터가 포함된 D2 심장 중배엽 규격 배지 1밀리리터에 재현탁합니다. 트리판 블루 10마이크로리터와 세포 현탁액 10마이크로리터를 마이크로튜브에 섞으세요.

선호하는 계수 방법으로 세포 수를 세고, D2 심장 중배엽 규격 배지에 2개의 미소소구 티아조비빈을 보충하여 100,000 세포/밀리리터 농도로 희석합니다. 셀 현탁액을 적절한 크기의 시약 저장소로 옮깁니다. 그 후 다중 채널 피펫을 사용해 초저용량 부착 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터를 투여하여 최종 웰당 10,000 세포 농도를 달성합니다.

500G에서 5분간 실온에서 돌려 인체 심장 오가노이드 형성을 유도하기 위해 현탁 배양 배양 과정을 거칩니다. 각 웰에서 크고 잘 경계된 세포 펠릿이 형성되는 것을 관찰하세요. 펠릿이 한계가 없다면 원심분리를 반복하세요.

24시간 후, 5마이크로몰라 IWP-2와 50마이크로그램/밀리리터 아스코르빈산(RB-1 플레이트 기준)을 포함한 D3 배지 10밀리리터를 준비합니다. 멀티채널 피펫을 사용해 기존 매체를 제거하지 않고 각 웰에 100마이크로리터의 D3 매체를 추가합니다. 다음 날, 각 웰에서 D3 매체 100마이크로리터를 제거하세요.

흡인 위험을 최소화하려면 플레이트를 45도 각도로 기울이고 멀티채널 피펫을 플레이트 측벽에 90도 각도로 고정하세요. 피펫을 웰 벽에 단단히 붙이고 천천히 흡입하세요. 배지를 제거한 후에는 5마이크로몰라 IWP-2가 RB 마이너스인 D4 배지 100마이크로리터로 교체합니다.

팁을 잘라낸 1,000 마이크로리터 피펫을 사용해 인간 심장 오가노이드를 1.7밀리리터 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 오가노이드가 튜브 바닥으로 가라앉도록 두고 과잉 배지를 부드럽게 제거하세요. 오가노이드를 한 번 세척할 때 인산염 완충 식염수를 추가하세요.

몇 초간 기다렸다가 남은 PBS를 부드럽게 제거하세요. 다음으로 4% 파라포름알데히드를 첨가해 오가노이드를 고정시키고, 관을 실온에 30분간 두어 고정을 돕습니다. 그 후 원하는 수의 고정 오가노이드를 1.7밀리리터 마이크로 원심분리관에 옮깁니다.

고정액을 제거하고 0.1% Tween 20이 함유된 PBS로 오가노이드를 세척합니다. 염색액에서 원하는 농도로 희석하여 1차 항체 용액을 준비합니다. 피펫을 사용해 각 마이크로 원심분리관에 1차 항체 용액을 50에서 100마이크로리터 단위로 첨가하여 오가노이드가 완전히 덮이도록 합니다.

배양 및 세척 후, 샘플을 염색액에 희석한 2차 항체와 함께 흔들기 플랫폼에서 4도 온도에서 24시간 배양합니다. 인큐베이션 후에는 앞서 설명한 세척을 수행합니다. 다음, 절단된 피펫 팁을 사용해 오가노이드를 양전하를 띤 유리 슬라이드 위에 옮깁니다.

Tween 20으로 과도한 PBS를 부드럽게 제거하고, 오가노이드를 덮기 위해 마운팅 매체를 몇 방울 떨어뜨립니다. 오가노이드 위에 덮개를 조심스럽게 덮어 납작하게 만듭니다. 그 후 형광 현미경을 수행합니다.

고정된 오가노이드를 30% 자당에서 4도 섭씨에 하룻밤 배양한 후, 플라스틱 몰드에 옮기고, 최적의 절단 온도 화합물을 소량 떨어뜨려 오가노이드를 덮을 만큼만 넣습니다. 가는 핀셋이나 피펫 팁을 사용해 오가노이드를 조심스럽게 재배치하여 뭉치지 않고 몰드 가장자리에서 멀리 떨어지게 합니다. 단일 냉동절부 내에 존재하는 개체 수를 최대한 늘리기 위해 오가노이드를 몰드 바닥에 최대한 가깝게 배치하세요.

금형을 드라이아이스 층이 있는 스티로폼 쿨러에 넣어 최적 절단 온도 화합물의 초기 층을 얼리세요. 화합물이 굳을 때까지 몇 분간 기다린 후 몰드를 작업대 위로 옮기세요. 몰드가 채워질 때까지 최적의 절단 온도 화합물을 추가하세요.

첫 번째 층이 완전히 녹을 때까지 기다린 후 곰팡이를 다시 드라이아이스에 넣어 완전히 얼리게 하세요. 냉동 후에는 몰드를 영하 80도에 보관하거나 냉동 분해하여 6마이크로미터 절면을 얻습니다. 피펫을 사용해 96웰 인간 심장 오가노이드 플레이트당 5밀리리터의 저산소증 배지를 세포 배양 플라스크에 옮깁니다.

플라스크를 저산소 챔버 안에 넣고, 5% 이산화탄소와 95% 질소로 이루어진 무산소 가스로 챔버를 3분간 세척합니다. 저산소증을 시작하기 전에 최소 1시간 동안 37도 C의 인큐베이터에 보관하세요. 다중 채널 피펫을 사용하여 인간 심장 오가노이드 플레이트의 모든 웰에서 약 150마이크로리터의 배지를 제거합니다.

그 후 200마이크로리터 피펫을 사용해 각 웰에서 남은 배지를 조심스럽게 제거하여 오가노이드를 손상시키지 않습니다. 각 웰에 저산소증 매체 50마이크로리터를 추가하세요. 인간 심장 오가노이드 플레이트를 저산소 챔버에 넣으세요.

그리고 5% 이산화탄소와 95% 질소로 구성된 무산소 가스로 챔버를 3분간 세척하세요. 저산소 챔버를 37도 섭씨 인큐베이터에 6시간 동안 보관하세요. 산소 재산화를 시작하려면 저산소실에서 인간의 심장 오가노이드를 제거하세요.

멀티채널 피펫을 사용해 각 웰에 150마이크로리터의 미리 예열된 RB+매체를 추가합니다. 마지막으로, 플레이트를 37도 섭씨의 인큐베이터에 넣고 최소 3시간 동안 재산소 공급을 허용한 후 하류 분석을 수행합니다. 6시간의 저산소증과 24시간의 재관류 후, 손상된 인간 심장 오가노이드에서 세포외 락산 탈수소효소 활성이 손상되지 않은 대조군에 비해 유의하게 증가했습니다.

저산소 처리를 받은 심장 오가노이드는 TUNEL 양성 심근세포 핵을 보였으며, 손상된 오가노이드에서 TUNEL 양성 심근세포 핵의 비율이 손상되지 않은 대조군에 비해 유의하게 높았다. 재산소 공급 전 저산소 기간이 길어질수록 흉터 형성이 시간 의존적으로 증가하는 것이 관찰되었습니다. 재관류 24시간 후, 손상되지 않은 인간 심장 오가노이드의 69%가 박동을 시작한 반면, 부상당한 오가노이드는 박동하지 않았습니다.

손상되지 않은 인간 심장 오가노이드는 다섯 개 관심 영역에서 동기화된 칼슘 과시현상을 보였으며, 피크는 동시에 나타나고 유사한 파형을 보였다. 손상된 인간 심장 오가노이드는 조정된 수축을 보이지 않고, 관심 영역 전반에 걸쳐 불규칙한 자발적 칼슘 일시성을 보였다. 이 프로토콜은 연구자들이 iPSC 유래 인간 심장 오가노이드에서 심근경색을 모방할 수 있게 합니다.

재현 가능한 손상을 보장하는 데 있어 가장 큰 기술적 도전은 기존 매체를 완전히 제거하는 것입니다. 향후 연구는 인간 심장 오가노이드 모델에서 조직 재생을 촉진할 수 있는 요인을 규명하는 데 중점을 둡니다.