고래류 모니터링을 위한 고래 관찰 선박에서 채취한 환경 DNA 샘플

이 프로토콜은 고래 관찰 크루즈 중 고래 eDNA 샘플링에 대한 표준화된 접근법을 제공합니다. 다양한 eDNA 샘플링 방법이 존재합니다. 이는 비교 데이터 분석을 방해합니다.

저희 프로토콜은 환경 조건에 최적화되어 오염 방지 장치를 갖추고 있습니다. eDNA 라디오 연구소의 지원을 받아, 이 프로토콜은 비전문가와 시민 과학자들이 고래 관찰 활동 중뿐만 아니라 전 세계적으로 수행할 수 있습니다. 우선, 현장 데이터 시트와 라미네이트 처리된 고래류 환경 DNA 샘플링 단계별 현장 프로토콜 등 현장 문서 자료를 준비하세요.

방수 마커, 플루크프린트당 두 개의 eDNA 필터, 충분한 장갑, 그리고 전용 폐기물 용기를 상자에 넣으세요. 선박 유형과 선상 구성에 적합한 1개 이상의 강성 버킷, 2차 환경 DNA 용기, 휴대용 연동 또는 진공 워터 펌프를 준비하세요. 모든 장비를 다룰 때는 장갑을 착용하고, 작업 중에는 장갑을 교체하세요.

장비를 멸균하려면 희석된 가정용 표백제 용액을 양동이, 뚜껑, 용기, 펌프 튜브의 모든 표면에 고르게 튀기세요. 수돗물로 세 번 깨끗이 헹구세요. 승객이 도착하기 전에 모든 물품을 탑승하여 지정된 청결 구역에 보관하세요.

선박 선원과 함께 샘플링 시간, 선박 위치 조정. 고래의 잠수를 예상하기 위해 수면 위 패턴을 관찰하세요. 고래가 잠수한 후 최대 10분 이상 지연되지 않도록 플루크 프린트에서 가능한 한 빨리 20리터의 바닷물을 채취하세요.

각 위치와 선박 유형에 맞는 맞춤형 물류 조건을 사용하여 다양한 지역에서 샘플을 채취합니다. 필요 시 수집된 물을 선상의 지정된 여과 스테이션으로 운반하여 유출을 방지하세요. 데이터 시트에 종 정체, 지리 위치 시스템 좌표, 시간, 샘플 복제 식별을 기록하세요.

여과 전에 장갑을 갈아야 합니다. 필터 백을 열고 필터를 출구 근처에서만 만지세요. 흡입구를 스노클에 삽입한 후 펌프 튜빙을 출구에 연결하세요.

스노클을 필터 하우징을 잠기지 않고 물 샘플에 담그고, 펌프를 빠르고 안정적인 유량으로 설정하세요. 10리터를 지속적으로 여과하면서 유량 안정성을 모니터링하세요. 다음으로, 필터를 뒤집고 펌프를 30초에서 60초 정도 돌려 잔여물을 제거합니다.

현장 조건에 맞게 필터링 펌프 구성을 맞춤화하세요. 펌프를 끄고 튜빙을 분리하세요. 필터를 원래 봉지에 넣고 즉시 라벨을 붙이세요.

장갑을 교체하고 두 번째 복제를 위한 필터링 준비를 하세요. 자기 보존 환경 DNA 필터는 안전하고 건조한 용기에 그늘진 주변 온도실에 보관하세요. 주변 온도가 20도 이상일 경우 필터를 냉장 보관하고 3개월 이내에 배송하세요.

모든 실험실 시술은 적절한 환기가 필요한 전용 자외선 멸균실에서 수행하십시오. DNA가 없는 장갑과 보호복을 착용한 후에는 작업대를 철저히 청소하세요. DNA 없는 겸자를 사용해 필터 막을 삼각형으로 접어 끝이 아래로 향한 2밀리리터 반응관으로 옮깁니다.

각 반응관에 380마이크로리터 TES 완충액과 20마이크로리터 단백질나제 K로 구성된 400마이크로리터 용해 완충제를 첨가합니다. 잠시 소용돌이로 56도 섭씨에서 최소 3시간 이상 교란하며 부화합니다. 필터를 바닥에 천공된 플라스틱 입구에 넣고, 실온에서 18,626G의 원심분리기를 10분간 가열하여 용해 버퍼와 필터를 분리하세요.

피펫 추출 시약을 세척판과 용출판에 넣습니다. 총 용해물 부피가 300마이크로리터를 초과할 경우 여러 개의 결합판을 사용하세요. 와류 자기 입자를 사용하고, 첫 번째 결합판에 우물당 30마이크로리터를 추가합니다.

두 개의 결합판에 대한 예비 DNA 채취 프로그램을 실행하고, 이후 DNA 추출 프로그램을 로봇에서 실행하세요. 모든 QPCR 반응을 3회로 실행하려면 필요한 마스터 믹스를 전용 작업 공간에서 준비하고 각 웰에 분산 배치하세요. 각 웰에 표적 DNA 표준 또는 eDNA 추출물을 3마이크로리터 추가하세요.

준비된 PCR 플레이트를 밀봉한 후, 3, 500G에서 10초간 원심분리한 후 플레이트를 실시간 정량 PCR 열사이클러에 넣습니다. 마지막으로, 최적화된 사이클 조건에서 분석을 실행하세요. 아이슬란드 스칼판디 만과 아조레스 제도에서 247개의 환경 DNA 또는 eDNA 샘플이 수집되었으며, 각 플루크프린트당 두 개의 자기 보존 eDNA 필터를 사용해 최대 10리터의 바닷물을 수집했습니다.

혹등고래 eDNA를 분석한 44개의 eDNA 필터 중 20개는 증폭 신호를 제공했고, 24개는 증폭 신호가 없었습니다. 추출 블랭크, 현장 대조군, 정량적 PCR 대조 검사에서 증폭 현상이 검출되지 않아 오염이 없음을 나타냈습니다. 양성 반응 중 9개의 eDNA 필터는 검출 한계보다 최소 한 단계 낮은 사이클 임계값을 기록했으며, 신뢰할 수 있는 검출로 분류되었습니다.

나머지 11개의 EDNA 필터는 검출 한계를 초과하는 사이클 임계값을 생성하여 그럴듯한 검출을 나타냈습니다. 아조레스 eDNA 필터의 평균 주기 임계값은 약 34.7로 약간 낮았으며, 아이슬란드 필터의 약 36.9에 비해 높았습니다. 아조레스와 아이슬란드 eDNA 필터 간 사이클 임계값 차이는 통계적으로 유의미하지 않았습니다.

이 프로토콜은 향후 해양 생물다양성 또는 고래 개체군 유전학을 조사하는 대규모 eDNA 샘플링 캠페인에 활용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 고래 관찰 선박에서 채취한 플루크 프린트에 포함된 eDNA를 통해 고래류 및 동재 분류군을 비침습적으로 검출하고 모니터링할 수 있게 합니다.