Name: CAR T 세포의 기능 프로파일링을 위한 구슬 기반 다중화 유동 세포분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 학습하세요 구슬 기반 다중화 유동 세포분석을 이용한 CAR T 세포 기능 프로파일링 방법입니다. 이 기술은 제한된 샘플에서 다중 효능 분자를 동시 정량 분석하여 면역학 연구 및 품질 관리에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Biery, D. N., Turicek, D. P., Diorio, C., Schroeder, B. A., Shah, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+standardization+of+cytokine+profiling+in+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Need for standardization of cytokine profiling in CAR T cell therapy.</a> Mol Ther. 32 (9), 2979-2983 (2024).</li>
<li>Boulch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-talk+between+CAR+T+cell+subsets+and+the+tumor+microenvironment+is+essential+for+sustained+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cross-talk between CAR T cell subsets and the tumor microenvironment is essential for sustained cytotoxic activity.</a> Sci Immunol. 6 (57), eabd4344(2021).</li>
<li>Teachey, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+predictive+biomarkers+for+cytokine+release+syndrome+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Cancer Discov. 6 (6), 664-679 (2016).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines%3A+From+clinical+significance+to+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokines: From clinical significance to quantification.</a> Adv Sci. 8 (15), 2004433(2021).</li>
<li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (8), 879-884 (2008).</li>
<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+Potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin Appl. 9 (3–4), 406-422 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+targets%3A+a+versatile+cell%E2%80%91free+platform+to+characterize+CAR+T+cell+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Artificial targets: a versatile cell‑free platform to characterize CAR T cell function in vitro.</a> Front Immunol. 15, 1254162(2024).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co%E2%80%91culture+model+with+CAR%E2%80%91T+cells%2C+antigen%E2%80%91presenting+cells%2C+and+tumor+cells+to+evaluate+CAR%E2%80%91T+cell%E2%80%91induced+cytokine+release+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro co‑culture model with CAR‑T cells, antigen‑presenting cells, and tumor cells to evaluate CAR‑T cell‑induced cytokine release syndrome.</a> Front Cell Infect Microbiol. 16, 1721114(2026).</li>
<li>Lock, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scaled%2C+transposon-based+production+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells.</a> J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).</li>
<li>Bethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+fully+human+FOLR1-targeting+CAR+T+cells+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of fully human FOLR1-targeting CAR T cells for the treatment of ovarian cancer.</a> Cells. 13 (22), 1880(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-125-800</td><td>빈대 기반 다중 cytokine 분석을 위한 흐름 세포 분석법</td></tr><tr><td>MACSPlex InspectoR Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>MACSPlex 데이터의 자동 게이팅 및 분석을 위한 웹 기반 도구</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>다중 데이터 측정의 흐름 세포 분석 기기</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-803</td><td>다중 데이터 측정의 흐름 세포 분석 기기</td></tr><tr><td>MACSQuant Express Mode</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>자동 게이팅 및 분석을 위한 소프트웨어</td></tr><tr><td>TexMACS Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-196</td><td>인간 및 마우스 T 세포의 배양 및 확장을 위해 개발된 최적화된 혈청 프리 세포 배양 배지</td></tr></tbody></table>

car t 세포의 기능 프로파일링을 위한 구슬 기반 다중화 유동 세포분석

Bead-Based Multiplex Flow Cytometry Assay for Functional Profiling of CAR T Cells

CAR T 세포의 기능 프로파일링을 위한 구슬 기반 다중화 유동 세포분석

Profiling CAR T cells presents challenges due to their heterogeneity, complex immune responses, and limited sample availability. Multiplex assays enable ...

본 연구는 CAR T 세포의 기능적 특성 분석에 중점을 두고 있으며, 이펙터 분자 분비 프로파일링을 위한 유세포 분석 호환 멀티플렉스 분석법을 개발하였습니다. 이 절차는 기능적 특성 분석, 기전 연구, 품질 관리(QC) 테스트 및 효능 평가를 위한 CAR T 세포 연구에 적용될 수 있습니다.우선, 표적 항원을 발현하거나 발현하지 않는 표적 세포를 사용하여, 이펙터 세포와 표적 세포의 비율을 2.5:1로 하여 엔지니어링된 인간 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR T cells)의 세포 배양물을 준비합니다. 분비된 사이토카인을 분석하거나 정해진 시간 범위 동안 사이토카인의 역학을 모니터링하기 위해 상층액 수집을 위한 하나 또는 여러 개의 시점을 설정합니다.펠릿에 200 µL의 완충액 또는 세포 배양 배지를 추가하여 분석물 표준품을 재구성하고 부드럽게 혼합합니다. 6개의 시약 튜브를 준비하고, 재구성된 표준품을 3.2 pg/mL 또는 0.6 pg/mL까지 1:5 연속 희석 시리즈로 준비합니다. 공시료(blank sample)를 준비합니다. 공동 배양 후 정해진 시간에 공동 배양물을 21 °C에서 300 g로 5분간 원심분리합니다. 상층액을 직접 사용하거나 표준 곡선 범위에 맞게 희석하여 사용합니다.MACSPlex 필터 플레이트의 웰당 200 µL의 MACSPlex 버퍼를 넣어 미리 적신 후, 진공 매니폴드나 원심분리기를 사용하여 웰의 액체가 모두 빠질 때까지 흡입합니다. 캡처 비드 믹스를 볼텍싱하여 비드를 완전히 재현탁합니다. 96-웰 필터 플레이트의 웰에 표준물질 또는 샘플 50 µL와 미리 희석된 비드 20 µL를 첨가합니다. 플레이트를 상온, 암소 조건에서 450 rpm으로 흔들어주며 2시간 동안 배양합니다. 진공 매니폴드를 사용하여 200 µL의 버퍼로 웰을 두 번 세척합니다. 웰에 1:50으로 미리 희석된 검출 시약 1을 100 µL 첨가합니다. 상온, 암소 조건에서 450 rpm으로 흔들어주며 1시간 동안 배양합니다. 웰을 두 번 세척합니다. 웰에 1:50으로 미리 희석된 검출 시약 2를 100 µL 첨가합니다. 상온, 암소 조건에서 450 rpm으로 흔들어주며 30분 동안 배양합니다. 웰을 한 번 세척하고 200 µL의 버퍼로 샘플을 재현탁합니다.캡처 비드 바이알의 2D 바코드를 사용하여 MACSQuant 유세포 분석기에 획득 설정을 로드하십시오. 소프트웨어에 로그인한 후, 샘플 랙으로 MACSPlex 필터 플레이트를 선택하십시오. 툴바의 Barcode 버튼을 클릭하여 2D 코드 리더기를 활성화합니다. 바코드가 깜박이는 빛을 향하도록 하여 리더기로부터 0.5에서 2.5 cm 거리로 바이알을 제시하십시오. Autolabel 탭에서 Capture Beads를 MPx human cytotoxic T, and natural killer cell로 지정하고 Nolabel을 선택하십시오. 세포 독성 T 세포 및 자연 살해 세포 표준품의 연속 희석을 위한 그룹 위치를 정의하십시오. Settings 탭에서 Express Mode를 선택합니다. type을 Analysis로 설정하고 mode를 MACSPlex_Standard로 설정하십시오. 그런 다음 gentle mixing을 적용합니다. 미지 샘플도 비슷하게 지정하고 그 위치를 정의하십시오. 선택 사항으로 샘플을 그룹화하고 샘플 식별자와 설명을 입력하십시오. Settings 탭에서 다시 Express Mode를 선택합니다. type을 Analysis로 설정하고 mode를 MACSPlex_Sample로 설정하십시오. 실험 테이블에서 랙 정의가 정확한지 확인하십시오. 필터 플레이트 웰의 액체 레벨이 적절한지 확인하고 측정을 시작하십시오. 청색 및 적색 레이저가 장착된 유세포 분석기를 사용하여 phycoerythrin 또는 PE, fluorescein isothiocyanate 또는 FITC 및 allophycocyanin 또는 APC 채널에서 데이터를 획득하십시오. MACSQuant 유세포 분석기에서 자동 게이팅 및 데이터 분석을 위해 express mode 템플릿이 사용되고 있는지 확인하십시오. 또는, 자동 정량 사이토카인 측정 및 내보내기 가능한 결과를 위해 FSC 또는 MQD 데이터 파일을 웹 기반 InspectoR 툴에 업로드하십시오. FITC 대 PE 채널에서 12가지 서로 다른 캡처 비드 집단이 적절히 분리되었는지 확인하십시오. 표준 곡선을 적용하여 사이토카인 농도를 계산하십시오. 마지막으로, 결과를 내보내고 시각화하십시오.다중 비드 인코딩을 사용하여, 개별 분석물을 나타내는 뚜렷한 비드 클러스터가 이축 도표에서 명확하게 분해되었습니다. 종양 표적 세포와 공배양한 후, CAR T 세포는 높은 수준의 granzyme B, interferon gamma(INF-gamma), tumor necrosis factor alpha(TNF-alpha) 및 granulocyte macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)를 분비하여 강력한 활성화와 세포 독성 작동 기능을 나타냈습니다. Interleukin-2(IL-2) 수준은 검출 한계 상한을 초과했으며, 이는 강한 증식 신호와 일치합니다. IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 및 monocyte chemoattractant protein 1(MCP-1)을 포함하여 조절 T 세포 또는 대체 헬퍼 T 세포 반응과 관련된 사이토카인들은 낮거나 거의 검출되지 않는 수준으로 존재했습니다. CAR T 세포는 항원 양성 표적을 인식함에 따라 빠르고 강력한 사이토카인 방출을 보였으며, 8~24시간 이내에 granzyme B, IFN-gamma, TNF-alpha, GM-CSF 및 IL-2가 강하게 상향 조절되어 48시간까지 정점 수준에 도달했습니다. IL-6, IL-17A, IL-21 및 perforin의 완만한 증가도 관찰되었습니다. IL-4, IL-10 및 MCP-1은 낮게 유지되거나 약간 상승했습니다. 항원 음성 표적과의 공배양에서는 모든 분석물에 걸쳐 사이토카인 유도가 최소한으로 나타났습니다.본 프로토콜은 CAR T 세포의 활성화 및 작동 기능을 반영하는 사이토카인, 케모카인 및 세포 독성 매개체의 정량을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 고려 사항은 공동 배양 기간, 작동 세포 대 표적 세포 비율, 시료 희석 및 정량 가능한 분석물 수준의 유지입니다. 이 절차에 따른 상층액 분석은 유세포 분석, CAR T 세포 표현형 분석 또는 세포 독성 분석과 병행할 수 있습니다.

bead-based-multiplex-flow-cytometry-assay-for-functional-profiling

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

유전 공학 또는 큰 샘플 크기를 요구하지 않고, 고유의 단백질 - 단백질 상호 작용의 구분, 강력하고, 생화학 평가를 허용하는 IP - FCM 방식은 제공됩니다.

IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

이 동영상은 샘플에서 여러 사이토카인 표적을 정량화하기 위한 멀티플렉스 비드 기반 면역 분석을 보여줍니다. 사이토카인 특이적 항체에 접합된 별개의 미세구체의 혼합물을 사용하여 샘플에 존재하는 사이토카인을 결합합니다. Streptavidin이 태그된 기자는 비오틴화 검출 항체를 사용하여 결합 사이토카인에 고정됩니다. 유세포 분석은 미세구의 고유한 크기와 내부 형광 강도를 기반으로 결합된 사이토카인을 식별하며, 리포터의 형광 강도는 사이토카인의 수를 나타냅니다.

여러 사이토카인 표적을 정량화하기 위한 멀티플렉스 비드 기반 면역분석법

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

눈물 영화 cytokines의 분석은 다양 한 안구 질환을 공부에 도움이 됩니다. 비드 기반 다중 분석 간단 하 고 민감한 고 작은 볼륨으로 샘플에서 여러 대상의 테스트를 활성화. 우리가 눈물 영화 cytokine 사용 하 여 프로 파일링에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기 비드 다중 분석 결과 기반으로.

구슬 눈물 Cytokine 프로 파일의 분석에 대 한 다중 분석 결과 기반으로

이 프로토콜에서는 조직 문화 supernatants 자극된 마우스 splenocytes 다중 구슬 기반된 immunoassay 플랫폼 및 교류 cytometer 사용 하 여에서 수집에 동시에 여러 cytokine 목표의 정량화를 설명 합니다.

Cytokine Profiling Immunoassay Cytometric 구슬-기반 플랫폼을 사용 하 여 자극된 마우스 Splenocytes의 다중화

절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 통한 세포 특성 분석은 임플란트에 대한 면역 반응 패턴을 이해하는 데 크게 기여할 수 있습니다. 이 논문은 절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 위한 염색을 위한 정확한 방법을 설명합니다.

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

이 보고서는 자동 슬라이드 염색기에서 다중 면역형광(mIF) 분석을 위한 자동 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 표준 고처리량 조직 자동염색기 및 전체 슬라이드 형광 이미저에서 공간 단백질체학의 높은 재현성을 보여주며, 이는 중개 연구에서 많은 수의 조직 슬라이드에 걸친 맞춤형 mIF 분석에 이상적입니다.

중개 연구를 위한 High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assay

여기에서는 단일 세포 수준에서 세포 사멸을 조사하기 위해 하나의 T 세포와 암 표적 세포를 캡슐화하는 이중 에멀젼 방울을 만드는 방법을 설명합니다. 이 방법은 많은 T 세포 집단 내에서 세포독성 분자와 표적 세포 사멸을 모두 이중 정량화할 수 있습니다.

단일 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 T 세포를 평가하기 위한 액적 기반 세포 독성 분석

Tregs는 면역 시스템의 강력한 진압하고 있습니다. 그들을 정의하는 독특한 표면 마커의 부족이있다, 그러므로, Tregs의 정의는 주로 기능입니다. 여기서 우리는 최적화된...

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

유동 세포 계측법하는 T 세포 내의 염색질의 상태를 평가하기 위해 이용 될 수있다. 이 프로토콜은 과학자 형광 히스톤 H3 항체의 평균 개화 강도 (MFI)의 증가에 의해 입증 T 세포 활성화시 염색질 decondensation의 기록을 해석 할 수 있도록...

유동 세포 계측법의 사용은 T 세포의 염색질의 상태를 평가하기 위해

학습하세요 구슬 기반 다중화 유동 세포분석을 이용한 CAR T 세포 기능 프로파일링 방법입니다. 이 기술은 제한된 샘플에서 다중 효능 분자를 동시 정량 분석하여 면역학 연구 및 품질 관리에 활용됩니다.

CAR T 세포의 기능 프로파일링을 위한 구슬 기반 다중화 유동 세포분석

더 많은 동영상 탐색