형태 측정 분석: 제브라피시에서 두개안면 형태 정량화를 위한 분석 소프트웨어 툴박스

저희 연구는 형태측정 소프트웨어를 사용하여 에탄올과 BMP7a가 상호작용하여 제브라피시에서 미묘한 두개면 결손을 일으키는지 정량화합니다. 선형 측정은 미묘한 변화를 놓치게 합니다. 이 방법을 통해 랜드마크를 이용해 형태 변화를 정량화하고 크기 차이를 제어합니다.

우선, tpsDigs2 소프트웨어를 열어보세요. 소스 입력을 클릭한 후 파일을 선택한 후 저장된 TPS 메모장 파일을 선택하세요. 옵션 버튼을 클릭하여 이미지 도구 옵션을 시각화하세요.

기준 길이를 100마이크로미터로 설정하고 Set 눈금을 누르세요. 확인을 눌러 축소 매개변수를 확인한 후 이미지 도구 창을 종료하세요. 그 다음 조준 기호를 클릭하고 메켈 연골 사이의 중간 이음부에 첫 번째 랜드마크를 배치합니다.

두 번째 랜드마크는 메켈 연골과 구개각연골 사이의 양측 관절에 위치시킵니다. 세 번째 랜드마크는 세라토히알 연골 사이의 정중 관절에, 네 번째 랜드마크는 구개사각암과 세라토히알 연골 사이의 양측 관절에 위치시킵니다. 그 다음 다섯 번째 랜드마크를 하악연골의 원위 끝에 배치하여 모든 이미지에 랜드마크가 같은 순서로 배치되도록 합니다.

랜드마크를 배치한 후 파일을 클릭하여 드롭다운 메뉴를 엽니다. 저장 데이터를 선택한 후 덮어쓰기로 업데이트된 파일을 저장하세요. tpsDigs2 소프트웨어를 종료하세요.

MorphoJ 소프트웨어를 실행하세요. 파일을 클릭하고 새 데이터셋 만들기를 선택한 후 데이터셋에 이름을 할당하세요. TPS를 클릭하고 새로 추가된 데이터 포인트가 포함된 메모장 파일을 선택하세요.

그 다음, 데이터셋을 만듭니다. 프로젝트 트리에서 데이터셋을 클릭하세요. 예비 단계를 선택하고, 그 다음에 새로운 프로크루스테스가 적합하다.

주축별로 정렬을 선택하고 프로크루스테스 맞춤 실행을 클릭하세요. 예비 항목에서 '공분산 행렬 생성'을 선택하여 프로크루스테스 좌표를 얻으세요. 프롬프트가 나오면 함수를 실행하세요.

이제 와이어프레임 생성 또는 편집을 선택하고 이미지 위의 포인트들을 연결하세요. 링크드 포인트를 클릭하고 이미지를 수락하거나 생성한 후, 필요에 따라 분류기를 편집하세요. MorphoJ를 열어둔 채 스프레드시트 프로그램을 열어보세요.

GENOTYPE, TREATMENT, GENOTYPE TREATMENT와 같은 분류기 정보를 입력한 후, 파일을 CSV 파일로 저장합니다. MorphoJ에서 파일을 클릭한 후 분류기 변수 가져오기를 선택해 CSV 파일을 불러옵니다. 프로젝트 트리로 돌아가서 데이터셋을 클릭하세요.

예비 항목에서 편집 분류기를 선택하여 모든 이미지가 포함되어 있는지 확인하세요. 프로젝트 트리에서 CovMatrix를 선택한 후 페이지 상단의 변형을 클릭하세요. 주성분 분석을 선택하여 주성분 점수를 계산하세요.

생성된 그래프를 보여주려면 PC 점수를 클릭하세요. 그래프를 우클릭하여 신뢰도 생략(Confidence Ellipsis)을 선택하여 원하는 분류기를 추가하세요. 색상 데이터 포인트를 선택하고 색상을 할당한 후 확인을 클릭하여 변경 사항을 적용하세요.

예비 항목에서 화면 하단에 있는 도형 그래프의 옵션 설정을 선택하세요. 와이어프레임 그래프를 선택하고 목표 도형, 시작 도형, 숫자의 색상을 수정하세요. 변형을 선택한 후 프로크루스테스 방학분석(ANOVA)을 선택하세요.

프로크루스테스 ANOVA 결과를 이전에 생성된 스프레드시트 파일로 내보내세요. MorphoJ에서 프로젝트 트리에서 원본 데이터셋을 선택하세요. 비교를 클릭한 후 정준변량 분석(Canonical Variate Analysis)을 클릭하세요.

분류기 변수 GENOTYPE TREATMENT를 선택하고 함수를 실행하세요. 결과를 내보내려면 결과 탭을 클릭하고 결과 페이지에서 우클릭하세요. 파일로 내보내기를 선택하고 결과를 저장하세요.

프로젝트 트리에서 정준 변량 분석을 선택한 후 점수를 선택하세요. 파일을 클릭하고 데이터셋 내보내기를 선택한 후 데이터 유형과 유전형 처리를 선택하세요. CVA 점수를 TXT 파일로 저장하세요.

PAST 소프트웨어를 위해 파일을 준비하려면 저장된 CVA 점수를 텍스트 편집기에서 열어보세요. 왼쪽 상단의 id를 Label로 바꾸고 편집한 파일을 저장하세요. PAST 소프트웨어를 열고 파일을 클릭한 뒤, 편집된 CVA 점수 파일을 선택하세요.

가져오기 창에서요. 이름, 행과 열의 데이터, 구분자로 탭을 선택한 후 가져오기를 클릭하세요. Show 탭에서 Column 속성을 선택하세요.

유형 옆 드롭다운 메뉴에서 분류기 변수가 포함된 첫 번째 열에 그룹을 할당하세요. 주성분 또는 정준 변량 데이터 열을 강조 표시하세요. 다변량을 선택한 후 검정(Tests)을 선택하고, 다변량 정규성을 선택하여 주성분과 표준 변량 데이터에 대해 정규성 검정을 별도로 실행하세요.

위 왼쪽 상단 모서리의 회색 빈 셀을 클릭하여 전체 데이터셋을 선택하세요. 다변량을 선택한 다음 검정(Tests)을 선택한 후 변이의 다변량 분석을 선택해 분석을 수행하세요. MANOVA 결과를 이전에 생성된 스프레드시트 파일로 내보내세요.

각 유전자형 및 처리군의 유충마다 내장 두개골 이미지를 촬영하였습니다. 내장 두개골의 연골을 대표적인 이미지에 라벨링하고, 각 이미지에 랜드마크를 배치하여 랜드마크 라벨이 붙은 데이터 세트를 생성했습니다. 주성분 1은 전체 형태 변이의 약 34%, 주성분 2는 전체 형태 변이의 약 20%를 차지했습니다.

각 주요 구성 요소는 모든 내장 두개암의 평균 형태에 비해 내두개의 형태에 특정한 변이를 보였다. 주성분 분석 그래프에서는 유전자형과 처리군 간 평균이 겹치는 현상이 나타나 뚜렷한 군집 현상이 없었습니다. 에탄올 처리된 야생형 유충은 표본 크기가 적어 평균의 95% 신뢰 타원을 보였습니다.

정준 변량 1은 마젠타 와이어프레임에서 세라토히알 관절이 평균 검은색 와이어프레임에 비해 미묘하게 짧아지거나 길어진 것을 나타냅니다. 정통 변량 2는 내장두개골의 한쪽 면에서만 메켈스-구개-구개-구개-구변이체 사이의 관절에서 이동을 보였다. 에탄올 처리된 야생형 유충은 평균의 95% 신뢰 타원을 보였으며, 이는 다른 모든 그룹과 겹쳤습니다.

변이의 다변량 분석 결과, 유전자형과 치료의 전반적 영향이 유의미하게 드러났습니다. 일관된 샘플 마운팅이 가장 큰 도전입니다. 기울어진 유충은 측정 부정확성을 일으키고 결과를 바꿀 수 있습니다.

이 프로토콜은 다양한 해부학적 구조에 적응하고, 3D 데이터를 분석하며, 선형 측정값을 생성하고, 실험 샘플 크기를 결정하는 데 도움을 줍니다. 향후 연구에서는 다른 유전자형 에탄올 민감도를 조사하고, 표본 크기를 확장하며, 이 다재다능한 도구를 다양한 해부학적 구조에 적용할 것입니다.