초기 임신 모체 면역 활성화 마우스 모델 생성을 통해 태아 염증이 신경발달에 미치는 영향을 평가한다

우리 연구실은 태전 염증이 뇌의 면역 세포인 미세아교세포의 생물학을 어떻게 변화시키는지 연구합니다. 기존 MI 모델은 임신 중기에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나 생존율과 일관성을 개선하기 위해 품질 관리 지표를 포함하는 초기 임신 프로토콜을 제시합니다.

이 모델은 환경 염증이 뇌 발달에 미치는 영향을 탐구하기 위해 모든 야생형 또는 유전적 마우스 모델에 적용할 수 있습니다. 우선, 늦은 오후나 저녁에 8주에서 10주 된 C57 BL6 암컷 마우스 두 마리와 C57 BL6 번식용 수컷을 배치하세요. 다음 날 아침, 암컷 쥐의 질 플러그를 평가하고 플러그가 발생할 때까지 하루에 한 번 계속 점검합니다.

플러그는 임시적이며 아침에 확인하지 않으면 오후쯤 빠질 수 있습니다. 질 플러그를 확인한 후에는 암컷 마우스의 체중을 재고 체중을 기록하여 임신 기간 동안 체중 증가를 추적해 임신 상태를 모니터링합니다. 플러그가 연결된 암컷을 개별 우리에 분리하여 표준 사육 조건 내에서 유지하며, 자유롭게 음식과 물을 얻을 수 있도록 하세요.

플러그된 여성을 임신 0.5일째로 지정하고, 질 플러그 삽입 날짜를 기록하여 임신 주수를 정확히 추적할 수 있도록 하세요. 동성건조된 폴리 IC를 고농도 스톡 용액으로 재구성하려면, 제조사의 지침에 따라 멸균 식염수 또는 멸균수에 녹여야 합니다. 고농도 스톡 용액인 보텍스.

그 후 용액을 식염수에 희석하여 저농도 육수를 만듭니다. 반복적인 동결-해동 과정을 피하기 위해 약 125마이크로리터의 저농도 재고를 1.5밀리리터 튜브에 담아 20도 또는 80도 섭씨에서 보관하세요. 배아 9.5일째에 주사 바로 전이에요.

저농도 폴리 IC 스톡을 멸균 식염수로 희석하여 작동 농도를 얻으세요. 이중 가닥 리보핵산 구조가 제대로 재배출되도록 작업 스톡을 65도 섭씨에서 10분간 가열합니다. 그 후 혼합물이 균질해지도록 용액을 소용돌이 또는 피펫으로 돌려 주입하세요.

임신을 확인하려면 배아 9.5일 아침에 댐을 재세요. 모체 면역 활성화(MIA)의 폴리-IC 주입량과 대조군의 0.9% 식염수 주입량을 계산합니다. 준비된 폴리-IC 작업 용액 또는 생리식염수의 적절한 양을 멸균 27게이지 이하의 주사기에 뽑아냅니다.

이제 댐을 제대로 고정해 통증과 고통을 최소화하세요. 폴리-IC산이나 식염수를 고관절 바로 위 왼쪽 또는 오른쪽 사분면, 또는 두 번째 유두 부위에 복강 내 주입하세요. 그 후 주사기는 BioSafety Sharps 용기에 버리세요.

또한, 주사 측 기록을 남겨 코호트 전체에 일관성을 유지하세요. 즉시 암을 집 케이지로 돌려보내고 문제가 있는지 모니터링하세요. 그 후 주사 후 최소 24시간 동안 우리에 하이드로겔을 보충하여 질병 행동과 관련된 탈수를 예방하세요.

그 후 poly-IC 주입량, 주사 날짜와 시간, 임신 주수, poly IC 로트 번호를 기록하세요. 주사 후 3시간 후, 각 쥐를 개별적으로 1분간 관찰하여 활동 감소, 구부정한 자세, 얼굴 찡그림, 묽은 변 등의 행동을 3점 척도로 평가합니다. 이러한 행동 중 하나 이상을 보이는 쥐를 급성 질병 행동으로 분류하세요.

그 후 꼬리 출혈과 같은 최소 침습 방법을 사용하여 주입된 암에서 모체의 혈액을 조심스럽게 채취합니다. 약 50마이크로리터의 혈액을 채취하세요. 지혈이 확인된 후에는 다섯을 홈 케이지로 돌려놓으세요.

모은 혈액을 실온에서 30분간 응고시키세요. 샘플을 2000G에서 실온에서 5분간 원심분리하여 혈전에서 혈청을 분리합니다. 샘플을 다시 원심분리한 후, 혈전을 건드리지 않고 투명한 상부 혈청층을 조심스럽게 채취하세요.

혈청은 20도 섭씨에 보관하여 하류 사이토카인 분석을 위해 준비하세요. 주사 후에는 3일 동안 매일 댐을 재어 폴리 IC산에 대한 반응을 관찰하세요. 예상 분만 당일에는 새끼 크기, 새끼 생존 가능성, 또는 무산을 포함한 새끼 결과를 기록하여 임신에 실패를 나타냅니다.

죽은 새끼는 즉시 제거하여 기관 생물안전 지침에 따라 처리하세요. 제조사 지침에 따라 산모 혈청 내 IL-6, TNF-α와 같은 염증성 사이토카인을 정량하기 위해 ELISA 또는 다중성 분석법을 사용하세요. 정량화 후에는 결과를 바탕으로 MIA 반응의 대표적 임계치를 설정하세요.

마지막으로, 저희 소프트웨어를 사용하여 산모 혈청 IL-6와 TNF 알파 수치 간의 관계를 통계적으로 분석합니다. 9.5일째에 폴리 IC 투여 후, MIA 댐은 대조 댐에 비해 IL-6 수치가 유의미하게 증가했습니다. TNF 알파 수치는 모체 IL-6 수치와 강한 양상관관계를 보였습니다.

배아 0.5일차부터 9.5일차 사이에 새끼를 성공적으로 낳은 암컷은 새끼를 낳지 못한 암컷보다 유의미하게 더 많은 체중을 증가시켰다. 주사 하루 후 MIA 댐은 체중이 줄었고, 식염수 처리된 대조 댐은 체중이 증가했습니다. 하지만 12일째 발생 시점에는 두 그룹 모두 비슷한 체중 증가를 보였습니다.

임신 전 체중은 식염수 처리 대조군 또는 MIA 댐에서 모래 효율에 영향을 미치지 않았습니다. 그러나 잭슨 연구소에서 공급한 C57 BL6 쥐가 MIA 절차 중 찰스 리버에서 채입한 C57 BL6 쥐보다 더 성공적인 새끼를 낳았습니다. 반면, poly IC의 원인은 쓰레기 효율에 영향을 주지 않았습니다.

더욱이, 잭슨 연구소에서 채취한 동물들은 Charles River에서 채취한 동물들에 비해 혈청 IL-6로 측정된 모체 염증 반응이 더 강했습니다. 반면, 모체의 염증 반응은 다양한 폴리 IC 출처 간에 동일하게 나타났습니다. 프로토콜은 초기 MIA 모델의 재현 가능성을 생성하고, 모체 염증의 심각도와 자손의 실험 결과를 상관관계 있게 합니다. 상세한 기록을 유지하고, 시약 로트 수를 추적하며, 모든 댐에서 모체 사이토카인 반응을 평가하는 것이 재현 가능한 결과를 보장하는 데 매우 중요합니다.