간 섬유증 마우스 모델에서 간 별형 세포 형태 매핑

이 프로토콜은 간별 세포 형태를 온전한 간 조직에서 시각화하고 모델링하기 위한 포괄적인 영상 파이프라인을 제공합니다. 현재의 2D 영상은 전체 별형 세포 형태를 놓치고 있어 구조적·기능적 통찰을 제한합니다. 이 프로토콜은 복잡한 3D 아키텍처의 견고한 캡처를 가능하게 합니다.

우선, 마취된 쥐의 손바닥을 꼬집어 적절한 마취를 확인하세요. 복부에 70% 에탄올을 뿌려 털을 적시세요. 겸자로 뒷다리와 일직선으로 된 복부 중앙의 피부를 집어 들어 피부를 자르기 시작해 복부를 드러내세요.

그 다음 PBS를 적신 면봉으로 장과 다른 장기를 옆으로 옮기고 왼쪽 엽을 들어 올립니다. 왼쪽 엽과 꼬리엽 사이에 붙은 막을 조심스럽게 잘라내세요. 그 다음 왼쪽 엽 윗부분 기부를 봉합합니다.

봉합 매듭 아래 왼쪽 엽을 잘라내어 조직 샘플 채취와 처리를 위해 따로 두세요. PBS에 젖은 면봉을 사용해 간을 움직이고 문맥을 드러내세요. 그 후 카테터 바늘을 문맥 길이의 중간쯤에서 조심스럽게 삽입합니다.

카테터 바늘을 제거하세요. 성공적인 삽입을 나타내기 위해 카테터를 통해 혈액이 역류하도록 하세요. 작동 중인 관류 펌프에서 채워진 튜브를 카테터에 연결하고 간에 20밀리리터의 PBS를 관류하세요.

간 위에 폐동맥을 고정기로 고정하여 PBS가 심장을 통과하지 못하게 막으세요. 하대정맥을 절단해 압력 축적을 풀어주세요. 펌프 속도를 분당 5밀리리터로 조절하세요.

15분 후 펌프를 멈추고 저장소를 4% 파라포름알데히드로 교체한 후 간에 4% 파라포름알데히드 25밀리리터를 주입합니다. 관류가 끝나면, 연결된 조직을 절단하여 간을 주변 장기에서 분리합니다. 간을 50밀리리터 원뿔형 튜브에 넣고 4% 파라포름알데히드 25밀리리터가 들어갑니다.

튜브를 차가운 방에서 4도, 분당 1.5회전으로 벤치를 흔드는 플랫폼 위에 수평으로 올려놓습니다. 다음 날에는 간을 PBS로 세 번 세척하고, 벤치 흔들기 플랫폼에서 각각 30분씩 실온에서 분당 1.5회전으로 세척합니다. 간을 20밀리리터의 PBS에 0.02% 아지드 나트륨을 넣어 4도 섭씨에서 보관합니다.

간 샘플을 약 0.5에서 1 입방센티미터 크기의 조각으로 잘라냅니다. 간 샘플을 나사 모양 유리 바이알에 옮기세요. 샘플을 물로 희석한 메탄올 시리즈에서 20%에서 80%까지 휠 로테이터에서 분당 8회전으로 상온에서 1시간 동안 탈수합니다.

샘플 표백, 투과, 면역표지 및 투명화를 수행한 후, 샘플을 상온에서 디벤질 에테르에 하룻밤 배양한 후 영상 촬영을 합니다. 샘플은 디벤질 에테르에 최대 1년간 보관할 수 있으며 염색 신호가 손실되지 않습니다. 공초점 영상을 촬영할 때, 투명화된 샘플을 1.5 유리 바닥이 있는 35밀리미터 유리 바닥 접시에 넣습니다.

접시에 에틸 계피를 채워 샘플을 완전히 잠깁니다. 그 다음 접시를 공초점 현미경 스테이지 위에 올려놓습니다. 1024 x 1024 포맷과 600 속도로 가장 밝은 평면에서 타일 이미지를 획득하여 샘플의 넓은 영역을 포착합니다.

타일 이미지를 바탕으로 관심 영역을 선택하여 더 높은 해상도의 Z-스캔을 수집합니다. 다음으로, 1024 x 1024 포맷과 600 스캔 속도를 사용하여 현미경이 지원하는 최고 해상도로 클리어된 조직 전체 깊이를 아우르는 Z-스택을 획득합니다. 쥐 간의 성공적인 관류 및 고정 결과, 균일한 연한 베이지색 노란색이 나타났습니다.

부적절한 관류는 혈전 부위에 짙은 붉은색 또는 갈색 부위를 남겨 광학적 선명도를 떨어뜨리고 이 부위에 높은 배경 신호를 초래했습니다. 디벤질 에테르에서 인큐베이션 후 조직이 투명해 보이는 완전한 광학 투명성이 달성되었습니다. 고해상도 Z-스택은 개별 간별 세포의 세포체에서 뻗어 나오는 미세한 수지상 돌기(sendritic process)를 밝혀냈다.

대조군과 만성 사염화탄소 간 샘플 모두 공초점 현미경 하에서 강하고 안정적인 형광 신호를 보였습니다. 이 파이프라인은 복잡한 미세환경 서버에서 별형 세포 형태를 재현 가능하게 매핑하여 수지상 돌기와 인접 세포와의 공간적 관계를 포착합니다. 시간 투자는 프로토콜을 수행할 때 중요한 고려 사항입니다.

청산 과정은 약 3주가 소요되며, 사전 계획이 필요합니다. 정밀한 3D 형태측정 분석을 가능하게 하는 이 플랫폼은 섬유아세포 구조를 기능과 연결하여 조직 항상성과 Z 메커니즘에 대한 통찰을 발전시킵니다.