효소 소화 및 밀도-구배 분리를 이용한 루이스 쥐로부터의 췌장 섬 분리 및 정제

저희 연구는 수율, 순도, 생존 가능성 및 기능적 수명을 최적화하기 위한 표준화된 고처리량 루이스 랫 아이렛 분리 프로토콜 개발에 중점을 둡니다. 기존 방법들은 불순하고 단명한 아이렛을 가변적으로 만듭니다. 이 프로토콜은 소화, 정화 및 축적을 표준화하여 일관성과 수명을 개선합니다.

먼저, 안락사한 쥐를 현미경 아래에 두세요. 피부 가위를 사용해 치골 합성부에서 각 측면 갈비뼈 쪽으로 V자 모양의 절개를 하여 복강에 접근합니다. 납작한 겸자를 사용해 소장과 대장을 동물의 왼쪽으로 당겨 복강 작업 공간을 정리합니다.

그 다음 평평한 겸자와 곡선 지혈기를 사용해 상부 십이지장을 펼치세요. 총담관과 간문맥이 시야 내에 있는지 확인하세요. 이제 곡선 지혈기를 사용해 간을 두부 방향으로 후퇴시킵니다.

간에서 1에서 2밀리미터 떨어진 곳에서 담관과 간정맥을 클램프로 고정하세요. 현미경 시야 아래, 평평한 겸자와 평평한 지혈기로 십이지장 내 내용을 부드럽게 움직여 청각 괄약근을 통과시킵니다. 그 후 십이지장을 오디 괄약근 양쪽에서 약 5밀리미터 정도 부드럽게 클램프하여 주변 부위를 분리합니다.

조직의 완전성을 유지하기 위해 최소한의 압박을 유지하세요. 멸균된 WDM이 담긴 주사기의 바늘을 십이지장 벽을 통해 조심스럽게 삽입하세요. 바늘을 괄약근체를 통과시켜 주 췌관으로 밀어 관류를 시킵니다.

일정한 압력을 유지하면서 췌장이 완전히 팽창할 때까지 약 초당 500마이크로리터의 속도로 7에서 10밀리리터의 WDM을 관류합니다. 이제 십이지장에서 두 개의 평평한 지혈기를 모두 제거하세요. 그 후 비장, 위, 대장, 십이지장, 간막에서 췌장을 부드럽게 해리하여 주변 구조물에서 분리합니다.

관류된 췌장을 평평한 겸자로 부드럽게 들어 올리고, 미세 해리 가위로 남아 있는 결합 조직을 절단합니다. 즉시 절제된 췌장을 얼음 세척용액이 담긴 페트리 접시로 옮기고, 제거된 췌장을 세척하는 동안 다음 췌장을 채취하세요. 췌장을 청소할 때는 가늘게 굽은 겸자와 가위를 사용해 림프절, 지방 조직, 간간막, 그리고 큰 혈관을 조심스럽게 제거하세요.

깨끗한 췌장을 멸균된 600밀리리터 비커에 25밀리리터의 차가운 WDM을 넣습니다. 수술 작업실에서 세포 배양 작업장으로 옮길 때 청결을 유지하기 위해 비커를 멸균 알루미늄 호일로 덮으세요. 비이커를 분당 130회전으로 설정된 궤도 셰이커 물욕에 10분간 옮깁니다.

5분 지점에서 비커를 시계 방향으로, 그리고 반시계 방향으로 수동으로 돌려 조직 해리를 돕습니다. 10분이 되면 비커를 빠르게 옮겨 얼음에 담가서 효소 활동을 늦추세요. 그 다음 비커 용액에 같은 양의 소결 완충제를 넣어 소화를 멈춥니다.

50밀리리터 주사기에 14게이지 척추 바늘을 장착해 조직 부유물을 부드럽게 흡인하고 반복해서 배출하여 큰 조직 조각을 해리합니다. 서스펜션을 200밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기세요. 현탁액을 원심분리한 후, 상원액을 조심스럽게 디캔트한 후 펠릿을 100밀리리터의 세척 매체에 다시 부유합니다.

이제 부유액액을 멸균된 500마이크로미터 체로 600밀리리터 무균 비커 위에 올려 큰 미소화 조직을 제거합니다. 여과액을 새로운 200밀리리터 원뿔 튜브로 옮긴 후 다시 원심분리합니다. 아이렛 정제를 위해서는 사전 결합된 10밀리리터 혈청학 피펫을 사용해 각 조직 펠릿을 2밀리리터 펠릿 부피당 15밀리리터의 그라디언트 용액에 재현탁합니다.

서스펜션이 균일해질 때까지 부드럽게 섞으세요. 각 50밀리리터 원뿔관 바닥에 셀 현탁액 15밀리리터를 조심스럽게 분비하여 튜브 벽과 접촉하지 않도록 하여 깨끗한 구배를 유지하세요. 그 후 주사기 펌프를 사용해 각 구배당 10밀리리터를 분당 5밀리리터의 속도로 분당 5밀리리터씩 분중 10밀리리터씩 분사하며, 16게이지 바늘 끝을 튜브 내부 벽에 대어 혼합을 방지합니다.

튜브를 원심분리한 후, 구배층 사이의 경계에 위치한 아이렛 층을 식별합니다. 결합형 과거 피펫을 사용해 아이렛 층을 수집하고, 수집한 아이렛을 5밀리리터 세척 매체가 들어있는 200밀리리터 원뿔형 사전 냉각 튜브로 옮깁니다. 세척 매체와 함께 부피를 200밀리리터로 올리고 다음 세척 및 원심분리 단계를 수행하세요.

그 후 췌장 5개당 1판씩 사용해 아이렛을 비조직 배양 처리된 100밀리미터 페트리 접시에 고르게 도금합니다. 시험 분리 전반에 걸쳐 50에서 100마이크로미터 빈 내 중간 직경인 췌장 당 3,330개의 아이렛 상당량이 생산되었습니다. 자동 크기 측정 결과는 총 98,832개의 물체를 얻었으며, 이는 0일째에 측정된 수동 눈꺼풀 등가물과 강한 상관관계를 보였습니다.

내분비 순도는 디토존 염색 결과를 기준으로 약 98.56%였습니다. 자극 지수는 첫째 날 9.37, 셋째 날 8.34, 일째 일차 6.7이었으며, 시점 간 유의한 차이는 없었습니다. 이 방법은 아이렛 이식, 베타 세포 기능, 당뇨병 역전, 아이렛 캡슐화, 아이렛 면역 또는 미세 환경 상호작용 연구를 가능하게 합니다.

이 프로토콜은 고순도 루이스 랫 아이렛이 필요한 전임상 이식, 당뇨병 모델링, 캡슐화 연구, 그리고 체외 기능 검사에 적용할 수 있습니다.