노령 눈물 및 침샘에서 단세포 해리, RNA 시퀀싱 및 노령 분수선에서 근상피세포 및 섬유아세포 분리 프로토콜
April 24th, 2026
이 프로토콜은 노화 마우스 눈물선을 해리하여 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 생존 가능한 단일 세포를 얻는 최적화된 방법을 설명합니다. 순차적 효소 소화와 부드러운 취급은 세포의 무결성을 유지하여, 세포 유형 특이적 분리 및 노화 관련 눈물샘 변화의 전사체 분석에 적합한 고품질 현탁액을 생성합니다.
저희 연구실은 유세포분석과 단일 세포 RNA 시퀀싱을 통해 침과 분비선의 연령 관련 변화가 다양한 세포 유형에 미치는 영향을 연구합니다. 표준 해리 방법은 노화된 침과 눈샘에서 연약한 상피세포를 제대로 회복하지 못합니다. 그리고 제 프로토콜은 세포 생존력을 높이고 신뢰할 수 있는 단일 세포 분석 및 세포 분류를 가능하게 합니다.
먼저, 안락사된 쥐를 해부 테이블 위에 누워 눕히세요. 가는 겸자와 가위를 사용해 눈과 귀 사이 피부를 절개합니다. 피부를 부드럽게 젖혀 젖샘을 드러내세요.
둔한 팁 겸자를 사용해 눈물선을 살짝 들어 올립니다. 주변 결합 조직을 원을 그리며 부드럽게 떼어내세요. 눈샘의 보이는 경계를 식별하고, 이를 인접 조직, 특히 이하선과 분리하세요.
그 후 눈물샘을 얼음 위에 2밀리리터 차가운 PBS가 들어 있는 35밀리미터 페트리 접시로 옮깁니다. 해부 현미경으로 남은 지방을 제거하고, 눈샘에서 결합조직 캡슐을 조심스럽게 제거합니다. 멸균된 35밀리미터 페트리 접시를 얼음 위에 올려놓으세요.
접시 중앙에 800에서 1000마이크로리터의 차가운 PBS를 추가하고 한 개의 분수선을 PBS로 옮깁니다. 조직이 PBS에 계속 잠겨 있도록 하세요. 두 개의 멸균 메스를 사용해 눈물선을 부드럽고 반죽 같은 질감이 될 때까지 작은 조각으로 가늘게 다집니다.
조직 조각을 접시 한쪽에 모으세요. 잔류 PBS를 흡취하고 신선한 냉각 PBS 1밀리리터로 조각을 세척하세요. 세척된 조직 조각을 12웰 플레이트에 옮기고, 웰당 2밀리리터의 예열된 소화 배지를 넣습니다.
접시를 흔드는 물에 넣고 37도 섭씨, 분당 60회전으로 30분간 부양합니다. 넓은 구경 1밀리리터 피펫 팁을 사용해 조직을 15번 부드럽게 분쇄합니다. 접시를 다시 흔들리는 물에 넣고 추가로 30분 정도 부양하세요.
다음으로 일반 1밀리리터 피펫 팁을 사용해 샘플을 10번 부드럽게 분쇄한 후 다시 30분간 배양합니다. 그 후 샘플을 10번 부드럽게 분쇄한 후 세포 부탁액을 2밀리리터 돌고래 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 각 웰에 1밀리리터의 콜드 블로킹 배지(BM1)를 추가하여 잔류 세포가 포함된 소화 배지를 수집하고, 다음 단계까지 접시를 얼음 위에 올려둡니다.
세포 현탁액이 담긴 튜브를 300G에서 4도 섭씨에서 5분간 원심분리합니다. 각 튜브에서 상정액을 버리세요. 잔류 세포가 포함된 플레이트의 각 웰에서 BM1을 해당 튜브로 옮깁니다.
다음으로, 각 웰에 600마이크로리터의 차가운 BM1을 추가하여 남은 셀을 헹구고, 워시를 해당 튜브로 옮겨 셀 현탁액과 결합시킵니다. 세포 현탁을 부드럽게 다시 현지하세요. 튜브를 다시 300G에서 4도에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다.
세포 펠릿에 1밀리리터의 아큐타제를 추가하고 부드럽게 재현수하세요. 튜브를 섭씨 37도, 분당 60회전으로 5분에서 10분 동안 인큐베이팅합니다. 1밀리리터 피펫 팁을 사용해 샘플을 부드럽게 10번 분쇄합니다.
그 후 튜브에 1밀리리터의 차가운 BM2를 첨가하여 Accutase를 희석하여 효소 반응을 종료합니다. 튜브를 300G에서 4도에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다. 200단위/밀리리터 농도로 DNase 1을 함유한 배지를 튜브에 넣어 세포를 다시 부탁하고 튜브를 위쪽까지 채웁니다.
튜브를 실온에서 10분간 부양시키고, 5분 후 부드럽게 다시 부드럽게 재현기하세요. 한편, 70마이크로미터 셀 체를 15밀리리터 원뿔관 위에 올리고, 1밀리리터의 BM3로 체를 미리 적셔 주세요. 배화 후에는 세포 현탁액을 체에 옮깁니다.
원래 수집관에 BM3 1밀리리터를 넣어 세척한 후 같은 체에 세척액을 옮기세요. 체를 BM3 5밀리리터로 세척하세요. 마지막으로, 트리판 블루 염색과 자동 셀 카운터를 사용하여 여과된 세포 현탁액의 농도와 생존 가능성을 측정합니다.
유전자 발현 프로파일링을 위한 단일 세포 RNA 시퀀싱이나 형광 표지 세포군의 유동 세포 분류 등 후속 응용을 진행합니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터를 분석한 UMAP 분석은 근상피세포와 섬유아세포를 포함한 젖샘 내 잘 대표되는 상피 및 기질 집단과 다양한 면역 세포 집단을 확인하였습니다. 노화된 눈물선에는 풍부한 혈장과 IGHM 및 IGHD를 발현하는 활성화된 B 세포가 포함되어 있었습니다.
순차적 유세포분석법 게이팅을 통해 EpCAM 양성, GFP 양성 근상피세포를 EpCAM 음성 GFP 양성 벽 세포와 명확히 분리할 수 있었습니다. PDGFR 알파를 발현하는 GFP 양성 섬유아세포는 EpCAM 음성으로, 상피세포와의 구별이 가능했습니다. PDGFR 알파, EGFP 마우스에서 모든 GFP 양성 세포는 콜라겐 1도 발현하여 섬유아세포 동일성을 확인했습니다.
유세포분석 결과, GFP 양성 세포의 99.6%가 PDGFR 알파 면역염색 세포와 일치하는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜은 상피, 기질, 면역 집단의 분자 특성화를 위해 눈물선에서 생존 가능한 단일 세포를 분리하도록 설계되었습니다. 주요 과제는 연약한 노화 조직 해리 과정에서 기계적 및 효소적 스트레스를 최소화하면서도 단일 세포 RNA 시퀀싱에서 높은 세포 생존력을 유지하는 것입니다.
이 절차를 거쳐 분리된 세포는 단일 세포 RNA 시퀀싱, 벌크 RNA 시퀀싱, 특정 세포 집단의 분자 프로파일링에 사용할 수 있습니다. 분리된 세포는 하위 기능 분석(function assay)을 위해 배양될 수도 있습니다.
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Overview
This article presents an optimized protocol for isolating viable single cells from aged mouse lacrimal glands (LGs), enabling high-quality single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and flow cytometry analysis. The method addresses challenges posed by increased fibrosis, cellular fragility, and lipid accumulation in aged LGs, ensuring efficient dissociation and recovery of diverse cell types for downstream molecular profiling.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular and molecular biology
- Ophthalmology and exocrine gland research
- Single-cell transcriptomics
Background
- Aging of the lacrimal gland leads to reduced tear secretion and chronic inflammation, contributing to dry eye disease.
- Age-related changes include immune cell infiltration, cellular damage, lipid accumulation, extracellular matrix deposition, and ductal dilation.
- Single-cell RNA sequencing is a powerful tool for profiling cellular heterogeneity and transcriptional changes during aging.
- Obtaining viable single-cell suspensions from aged LGs is technically challenging due to tissue fragility and fibrosis.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for efficient dissociation of aged mouse lacrimal glands.
- To enable isolation of multiple cell types suitable for scRNA-seq and flow cytometry.
- To minimize cell damage and maximize viability during tissue processing.
Methods Used
- Careful dissection and mincing of lacrimal gland tissue from euthanized mice.
- Stepwise enzymatic digestion using Collagenase IV, Dispase II, DNase I, and Accutase.
- Use of pre-coated plasticware and controlled temperature/agitation to reduce cell stress.
- Red blood cell lysis and sequential filtration through strainers to enhance cell purity.
- Cell type-specific isolation using reporter mouse lines (Acta2GFP and PdgfraEGFP) and fluorescence-activated cell sorting (FACS) after immunostaining with EpCAM antibody.
Main Results
- The protocol yields high-quality, viable single-cell suspensions from both aged and young lacrimal glands.
- UMAP analysis of scRNA-seq data identified well-represented epithelial, stromal, and diverse immune cell populations.
- FACS enabled clear separation and identification of myoepithelial cells (EpCAM+, GFP+) and fibroblasts (PDGFRα+, EpCAM-).
- In aged LGs, abundant plasma and activated B cells expressing IGHM and IGHD were detected.
- 99.6% of GFP-positive cells corresponded to PDGFRα-immunostained fibroblasts, confirming cell identity.
Conclusions
- This protocol enables efficient and gentle dissociation of aged lacrimal glands for single-cell analysis.
- It supports high cell viability and recovery of multiple cell types, including fragile epithelial and stromal populations.
- The method is adaptable to other fibrotic or aging exocrine tissues requiring targeted cell isolation.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Efficient single-cell dissociation and isolation from aged lacrimal and salivary glands addresses a critical bottleneck in profiling cellular heterogeneity and transcriptional changes associated with tissue aging and fibrosis. This protocol enables high-viability recovery of fragile epithelial and stromal populations, supporting robust single-cell RNA sequencing and targeted cell sorting for discovery-stage research. The method enhances predictive confidence in cell-type specific molecular characterization, informing early target validation and mechanistic de-risking in exocrine gland disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of age-related cellular and molecular changes in exocrine tissues.
- Supports functional target validation by isolating viable myoepithelial cells and fibroblasts for downstream analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing high-quality single-cell suspensions for transcriptomic profiling.
- Improves predictive confidence in disease-relevant system modeling for dry eye and related disorders.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell suspensions suitable for high-throughput scRNA-seq and flow cytometry workflows.
- Standardizes dissociation and isolation steps to maximize reproducibility and quantitative output quality.
- Enables reliable cell-type specific sorting using FACS and reporter mouse lines for assay development.
- Supports scalable adaptation to other fibrotic or aging exocrine tissues with similar dissociation challenges.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling outputs with disease-relevant biomarkers in aged tissue models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional assays on sorted cell populations.
- Reduces biological risk in translational studies by ensuring high cell viability and purity for downstream applications.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust single-cell analysis and targeted cell isolation from challenging aged tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in age-related exocrine gland dysfunction.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity single-cell suspensions for quantitative transcriptomic and cytometric assays.
- Analytics: Provides cell-type resolved molecular data and enables statistical comparison of cellular populations across age groups.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and functional validation in disease-relevant aged tissue models.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse exocrine tissues, supporting platform scalability and cross-program standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-type specific analyses.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of single-cell workflows in aged and fibrotic tissues.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage molecular profiling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of programs targeting exocrine gland dysfunction and aging.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic dissociation, and flow cytometry-based cell sorting.
- Demands access to automated cell counters, FACS instrumentation, and single-cell RNA sequencing platforms.
- Necessitates cross-team standardization of dissociation and sorting protocols for reproducibility.
- Adaptation to other tissues may require optimization of enzyme concentrations and incubation times.
- Cell viability and yield may be limited by tissue fibrosis and cellular fragility in advanced aging models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:36
Lacrimal Gland Tissue Isolation from PdgfraEGFP Transgenic Mouse
1:38
Fragmentation of Harvested Lacrimal Gland Tissue
2:27
Enzymatic Digestion of the Tissue Fragments and Primary Washes
4:30
Accutase and DNase I Treatment
6:33
Results
7:58
Conclusion
