산소 전달 응용을 위한 계층적 다공성 UiO-66 나노입자에서의 합성, 헤모글로빈 캡슐화 및 이교수 PEGylation

이 연구의 목적은 헤모글로빈 캡슐화와 산소 전달을 위한 안정적인 금속-유기 프레임워크, MOF 기반 나노입자를 정의하는 것입니다. 계층형 다공성 형태는 헤모글로빈 캡슐화의 크기 제한을 극복할 수 있으며, 표면 개체군은 생리적 환경에서 입자의 안정성을 향상시킬 수 있습니다. 먼저, 준비된 계층적 다공성 UIO 66 아민 나노입자 50밀리그램을 25밀리리터 둥근 바닥 플라스크에 정확히 무게를 재세요.

플라스크에 테트라하이드로푸란 10밀리리터를 추가하세요. 그 후 혼합물을 5분간 초음파 검사하여 입자를 완전히 분산시켜 균일하고 불투명한 현탁액을 만듭니다. 둥근 바닥 플라스크를 400 RPM으로 설정된 자석 교반기 위에 얼음물에 넣으세요.

유리 주사기를 사용해 5분 동안 5도 이하로 유지하면서 0.4밀리리터의 tert 부틸 아질산염을 점차 투여합니다. 즉시 같은 냉기 조건에서 0.35밀리리터의 트리메틸 SL 아지드를 점방별로 첨가하세요. 약간의 기품이 나타날 수 있는데, 이는 질산화 진행 상황을 나타냅니다.

그 다음 얼음물 욕조를 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 반응을 보호하세요. 반응 혼합물을 얼음물에 담근 밤새 계속 저어주세요. 다음 날에는 보여주는 대로 세탁하고 건조하세요.

그 후 FTIR 분광법을 사용해 화학 변환을 검증합니다. 계층적으로 다공성인 UIO 66 아지드 나노입자 5밀리그램을 2밀리리터 원심분리관에 옮깁니다. HEPES 버퍼 0.5밀리리터를 추가하고 2분에서 5분간 초음파 처리합니다.

헤모글로빈 20밀리그램을 포함한 HEPES 완충액 0.5밀리리터를 추가하고, 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 나노입자를 완전히 분산시킵니다. 이제 튜브를 열셰이커에 올려놓고 실온에서 1,000RPM으로 흔들며 2시간 동안 배양합니다. 배양 후에는 13,500G에서 실온에서 5분간 원심분리하여 계층적으로 다공성인 UIO 66 아지드 나노입자를 펠릿으로 적재합니다.

그 후 상청액을 조심스럽게 채취하여 갇히지 않은 헤모글로빈의 정량화를 수행합니다. 피펫으로 위아래로 피펫을 흔들어 펠릿을 세 번 부드럽게 세척하여 느슨하게 흡수된 헤모글로빈을 제거하세요. 그 후 각 세척액의 상원액을 조심스럽게 채취하여 갇힌 헤모글로빈을 정량화합니다.

최종 펠릿을 0.5밀리리터의 초순수수에 재현탁한 후 특성 분석하기 전에 냉장에 보관합니다. 회계 나트륨 황산염 헤모글로빈 분석을 사용하여 수집된 상청액 내 포획된 헤모글로빈을 확인합니다. 각 상청액 10마이크로리터를 96웰 마이크로플레이트에 피펫팅합니다.

황산나트륨 100마이크로리터를 첨가하고 실온에서 어두운 환경에서 5분간 배양합니다. 자외선 가시광선 분광광도계를 사용하여 412나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 그 후 HEPES 버퍼에서 헤모글로빈 재고를 연속 희석하여 표준 곡선을 생성합니다.

준비된 희석물을 준비된 96 웰 플레이트에 옮겨 흡입도 측정값을 헤모글로빈 농도로 변환하는 표준 곡선을 생성합니다. 계층적으로 다공성인 UIO 66 아지드 나노입자 10밀리그램을 2밀리리터 원심분리관에 0.5밀리리터의 초순수수를 넣고 2분에서 5분간 초음파 처리합니다. 20밀리그램의 디벤조사이클로옥탄을 추가하고, 이 첨가물에 폴리에틸렌글리콜과 나노입자의 비율이 등하도록 합니다.

혼합물이 균질화될 때까지 튜브를 부드럽게 소용돌이로 돌립니다. 튜브를 열셰이커에 올려놓고 실온에서 1,000 RPM으로 1시간 동안 진동시키며 배양합니다. 그 후 튜브를 4도 섭씨로 유지된 냉장고에 옮겨 하룻밤 반응을 시도합니다.

튜브를 12,000G에서 실온에서 5분간 원심분리하여 폴리에틸렌글리콜 변형, 헤모글로빈 적재, 계층적으로 다공성인 UIO 66 나노입자를 펠릿으로 만듭니다. 그 후 반응성이 없는 폴리에틸렌글리콜이 포함된 상청액을 버립니다. 앞서 시연한 조건에서 피펫팅을 위아래로 움직이고 원심분리하여 2밀리리터 초순수수로 펠릿을 세 번 세척하세요.

정제된 페기질화 헤모글로빈이 적재되고 계층적으로 다공성인 UIO 66 폴리에틸렌 글리콜 나노입자를 초순수 2밀리리터에 재현탁합니다. 서스펜션은 섭씨 4도에서 보관하세요. 결과적으로 생성된 콜로이드는 균질하고 약간 오팔빛을 띠어 분산 안정성이 우수함을 나타냅니다.

그 다음 동적 광산란(DLS)으로 페질화가 성공하는지 확인하세요. 표면 아미노기들은 성공적으로 아지드로 전환되었다. 이는 계층적으로 다공성인 UIO 66 아지드 나노입자의 FTIR 스펙트럼 내 2,122 역센티미터 지점에 특징적인 비대칭 아지드 신축 밴드가 나타나면서 입증되었습니다.

이 밴드는 계층적으로 다공성인 UIO 66 아민 나노입자에서는 결여되었다. 헤모글로빈 캡슐화는 노란색에서 빨간색으로 뚜렷한 색 변화로 시각적으로 나타났습니다. 헤모글로빈 부하 후 질소 흡수가 감소하여 중간공이 헤모글로빈 분자가 점유함을 나타냅니다.

계층적으로 다공성인 UIO 66 아지드 나노입자의 제타 전위는 헤모글로빈 캡슐화 후 42.9밀리볼트에서 20.4밀리볼트로 감소했습니다. 폴리에틸렌글리콜의 성공적인 결합은 2,122 역센티미터에서 아지드 신장 진동이 사라지고 FTIR 스펙트럼에서 폴리에틸렌글리콜 관련 신호가 나타나면서 확인되었습니다. DLS 분석 결과, 페질화 후 유체역학적 직경이 약 114.9나노미터에서 140.8나노미터로 증가했으며, 낮은 PDI는 유지되었습니다.

이 입자는 계층적으로 다공성 형태 나노입자의 합성, 헤모글로빈 캡슐화, 표면 오염, 산소 방출 기능 평가를 가능하게 합니다. 이 프로토콜을 사용하면 추가적인 물리화학적 특성 분석과 기능적 연구가 수행되며, 시험관 내 산소 방출 및 나노입자 생체 적합성 분석도 포함됩니다. 향후 연구에서는 실질적 퇴화를 방지하기 위한 성분 포함과 같은 장기적인 이유를 위해 헤모글로빈 기능을 보존하는 데 집중할 수 있습니다.