돼지 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포와 지방세포의 효율적인 분리

이 연구의 목적은 지방 조직에서 세포를 효율적이고 신속하게 분리하는 것입니다. 전통적인 소화는 시간이 많이 들고 과소화될 수 있습니다. 저희 효소 및 기계식 파동 측정은 부드러운 분산을 제공하고 격리 시간을 단축합니다.

먼저, 안락사 시행된 돼지의 피하 지방 조직 조각을 배양 접시에 넣으세요. 지방 조직과 진피 사이의 자연 평면을 따라 해부하여 두께 2에서 3밀리미터 두께의 완전한 ULB 시트를 얻습니다. ULB는 얼음 차가운 멸균 식염수에 한 번 헹구세요.

멸균 배양 접시를 찢은 후, 멸균 접시의 조직을 미리 멸균된 저울로 무게를 재세요. 조직 1.8g마다 얼음 냉각 D-Hank's 완충제 10밀리리터를 추가하고, 조직을 완전히 담가둡니다. 멸균 수술용 가위를 사용해 조직에서 보이는 모든 혈관을 식별하고 절제하세요.

결합 조직과 섬유화 조직을 모두 제거하세요. 제거된 물질은 지정된 생물학적 위험 용기에 버려. D-행크의 버퍼 안의 조직을 헹구어 잔여 혈액과 이물질을 제거하세요.

멸균 배양 접시에서 조직을 미리 멸균된 저울로 재고, 접시를 찢은 후 무게를 재세요. 세척 조직 조각 1.8그램을 멸균 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 옮깁니다. 튜브에 800마이크로리터의 A형 조직 해리 완충제를 추가하세요.

멸균 안과 가위를 사용해 튜브 안의 조직을 약 1에서 2 입방밀리미터 크기의 조각으로 잘게 만듭니다. 다진 조직과 주변 완충제를 새로운 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 튜브에 A형 조직 해리제를 200마이크로리터 추가하세요.

튜브를 부드럽게 돌리고 손으로 세 번 흔들어 내용물을 섞으세요. 지방 조각이 해리 용액에 완전히 담겨 있는지 확인하세요. 튜브 캡이 꽉 닫혔는지 확인하세요.

튜브를 섭씨 37도 금속 욕조에 넣고 5분에서 10분간 배양합니다. 부분적으로 소화된 지방 조직을 완충 내에서, 기계적 해리 시스템용으로 지정된 멸균 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 200헤르츠 사인파를 이용해 기계적 해리를 수행하도록 지방 조직 사전 설정된 프로그램을 실행하세요.

세포 현탁액을 모아 200마이크로미터 셀 체를 통과시켜 새로운 50밀리리터 원심분리관에 넣습니다. 체에 4도 섭씨로 미리 냉각한 D-행크 용액 5밀리리터를 넣습니다. 체를 D-Hank 용액으로 두 번 헹구세요.

여과된 셀 현탁액을 500G에서 4도에서 5분간 원심분리합니다. 멸균 파스퇴르 피펫을 사용해 상원액 지질층을 흡입하고 제거하며, 지방 세포층을 보호하기 위해 1밀리리터의 완충재를 남겨둡니다. 지방이 포함된 두 번째 층은 세 번째와 네 번째 층을 방해하지 않고 채취하세요.

세 번째 층을 흡입하고 버리세요. 기질 혈관 분획(SVF)을 포함한 바닥 펠릿에 D.Hank's 버퍼 1밀리리터를 첨가합니다. 세포 펠릿을 완충기에 부드럽게 재현탁하여 세포 농도를 2에서 5 곱하기 10의 6 세포 1밀리터당 제곱으로 만듭니다.

SVF 셀 현탁액을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 준비하세요. 사용 전까지는 서스펜션을 얼음 위에 보관하세요. 멸균 0.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 10마이크로리터의 SVF 셀 현탁액과 0.4% 트리판 블루 용액 10마이크로리터를 추가합니다.

부드럽게 피펫을 위아래로 세 번 움직입니다. 착색된 세포 혼합물 10마이크로리터를 자동 셀 카운터에 적합한 카운팅 슬라이드로 옮깁니다. 샘플이 챔버를 완전히 채우고 넘치지 않는지 확인하세요.

자동 셀 카운터에 카운팅 슬라이드를 넣으세요. 트리판 블루 분석법을 선택하고 필요하다면 세포 농도 범위를 조정하세요. 자동 셀 카운팅을 시작하려면 카운트를 누르세요.

카운팅 챔버 이미지를 모니터링하고 살아있는 세포와 죽은 세포의 자동 구분을 관찰하세요. 세포 생존 가능 비율과 기기 화면에 표시된 총 생존 세포 수를 기록하세요. 각 샘플마다 세 가지 독립적인 측정을 수행하세요.

평균 생존력과 세포 수율을 1g 지방 조직당 계산하세요. D.Hank's에 5 마이크로그램/밀리리터 각각과 1 마이크로몰라 BODIPY 염색액을 준비합니다. 분리된 지방세포를 염색 용액에 37도 섭씨에서 15분간 배양합니다.

형광 현미경에 적합한 슬라이드 준비를 위해 자체 제작한 지방세포 친화적 슬라이드 커버 유리 시스템을 사용하세요. 자작 지방세포 친화적 장착 시스템 덕분에 온전한 지방 세포를 균일하게 분포하여 명확한 영상 촬영을 할 수 있었습니다. 전통적인 방법이 복잡하고 다층적인 배열을 만들어내는 것과 달리, 추출된 지방세포는 온전한 구조와 정상적인 형태를 보였다.

기계적 해리법으로 얻은 지방세포의 생존율은 전통적인 효소 가수분해법에 비해 유의미하게 높았습니다. 정제 및 배양된 지방 유래 줄기세포는 질서 정연하게 배열된 길쭉한 방추형 세포를 가진 균일한 섬유아세포 형태를 보였다. 대부분의 세포는 염색되지 않아 생존 가능성을 나타내는 반면, 소수의 세포는 죽은 세포를 나타내는 파란색 염색을 띠었습니다.

이 프로토콜은 연구자들이 지방 저장소 전역에서 분리된 세포 특성을 비교할 수 있게 합니다. 프로토콜에서 분리된 SVF는 오가노이드 구축과 지방 줄기세포 정제에 사용할 수 있습니다. 향후 연구에서는 저장소 전반에 걸친 세포외기질 지방 조직 변이를 고려하여 분리 방법을 더욱 최적화할 수 있습니다.