Name: AAV 형질도입 연구를 위한 3D 스페로이드 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 배우세요 AAV 형질도입 연구를 위한 3D 스페로이드 평가 방법을 통해 유전자 치료 벡터의 효능과 형질 발현 동역학을 정량적으로 분석하는 기술을 익히세요. 이 플랫폼은 다양한 세포주에서 혈청형 특이적 형질도입 효율을 평가할 수 있습니다.

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저자들은 AAV nanoluciferase 생산을 위한 플라스미드와 live substrate 시약을 제공해 준 Morten Seirup과 Trish Hoang에게 감사를 표합니다. 본 프로젝트는 미국 에너지부와 FDA 간의 기관 간 협정에 따라 Oak Ridge Institute for Science and Education이 관리하는 미국 식품의약국(FDA) CBER의 ORISE 연구 참여 프로그램 임명을 통해 지원받았습니다.

<ol>
	<li>Mendell JR, et al. Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol Ther. 2021;29(2):464-88.</li>
	<li>Byrne BJ, et al. Current clinical applications of AAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 2025;33(6):2479-516.</li>
	<li>Najera SS, et al. AAV2 delivery of the saCas9 gene results in presentation of an HLA-A*02:01-restricted T cell epitope potent to induce T cell cytotoxicity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(3):101506.</li>
	<li>Alhakamy NA, Curiel DT, Berkland CJ. The era of gene therapy: From preclinical development to clinical application. Drug Discov Today. 2021;26(7):1602-19.</li>
	<li>Arutyunyan IV, et al. Gene Expression Profile of 3D Spheroids in Comparison with 2D Cell Cultures and Tissue Strains of Diffuse High-Grade Gliomas. Bull Exp Biol Med. 2023;175(4):576-84.</li>
	<li>Cashen P, Manser B. Quality by design (QbD) for adeno-associated virus (AAV): A framework for a QbD assessment for AAV products within the chemistry manufacturing and controls (CMC) documentation [Internet]. Port Washington (NY): Pall Corporation; 2021. Available from: https://www.pall.com/.</li>
	<li>Center for Biologics Evaluation and Research. Potency Assurance for Cellular and Gene Therapy Products: Draft Guidance for Industry [Internet]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2023. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/potency-assurance-cellular-and-gene-therapy-products.</li>
	<li>Fu Q, Polanco A, Lee YS, Yoon S. Critical challenges and advances in recombinant adeno-associated virus (rAAV) biomanufacturing. Biotechnol Bioeng. 2023;120(9):2601-21.</li>
	<li>Martinez RA, et al. A versatile cell line for establishing potency of cell type-specific AAV transgenes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101401.</li>
	<li>Zengel J, et al. Development of cell lines with increased susceptibility to diverse adeno-associated viral vectors to enable in vitro potency assays. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101416.</li>
	<li>Marconi GD, et al. Three-Dimensional Culture System: A New Frontier in Cancer Research, Drug Discovery, and Stem Cell-Based Therapy. Biology (Basel). 2025;14(7):875.</li>
	<li>Bialkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Milowska K. Spheroids as a Type of Three-Dimensional Cell Cultures-Examples of Methods of Preparation and the Most Important Application. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6225.</li>
	<li>Ducker M, Millar V, Ebner D, Szele FG. A Semi-automated and Scalable 3D Spheroid Assay to Study Neuroblast Migration. Stem Cell Reports. 2020;15(3):789-802.</li>
	<li>Hiller T, et al. Generation of a 3D Liver Model Comprising Human Extracellular Matrix in an Alginate/Gelatin-Based Bioink by Extrusion Bioprinting for Infection and Transduction Studies. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3129.</li>
	<li>Jakeman PG, et al. Improved in vitro human tumor models for cancer gene therapy. Hum Gene Ther. 2015;26(5):249-56.</li>
	<li>Kapalczynska M, et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 2018;14(4):910-9.</li>
	<li>Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR Jr. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers (Basel). 2021;13(4):874.</li>
	<li>McRobb LS, Lee VS, Faqihi F, Stoodley MA. A Simple Model to Study Mosaic Gene Expression in 3D Endothelial Spheroids. J Cardiovasc Dev Dis. 2024;11(10):305.</li>
	<li>Ohguro H, et al. 3D Spheroid Configurations Are Possible Indicators for Evaluating the Pathophysiology of Melanoma Cell Lines. Cells. 2023;12(5):759.</li>
	<li>Casey G, et al. Self-complementarity in adeno-associated virus enhances transduction and gene expression in mouse cochlear tissues. PLoS One. 2020;15(11):e0242599.</li>
	<li>Hutt JA, et al. Scientific and Regulatory Policy Committee Points to Consider: Nonclinical Research and Development of In Vivo Gene Therapy Products, Emphasizing Adeno-Associated Virus Vectors. Toxicol Pathol. 2022;50(1):118-46.</li>
	<li>El Harane S, et al. Cancer Spheroids and Organoids as Novel Tools for Research and Therapy: State of the Art and Challenges to Guide Precision Medicine. Cells. 2023;12(7):1001.</li>
	<li>Najera SS, et al. Targeting NAD+ Metabolism Vulnerability in FH-Deficient Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Carcinoma with the Novel NAMPT Inhibitor OT-82. Mol Cancer Ther. 2025;24(2):200-13.</li>
	<li>Huang HL, et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 2010;17(1):36.</li>
	<li>Ripa I, Andreu S, Lopez-Guerrero JA, Bello-Morales R. Membrane Rafts: Portals for Viral Entry. Front Microbiol. 2021;12:631274.</li>
	<li>Habanjar O, Diab-Assaf M, Caldefie-Chezet F, Delort L. 3D Cell Culture Systems: Tumor Application, Advantages, and Disadvantages. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12200.</li>
	<li>Kaiser VM, Gonzalez-Cordero A. Organoids - the future of pre-clinical development of AAV gene therapy for CNS disorders. Gene Ther. 2025;Mar 27. Epub ahead of print. PMID: 40148593.</li>
	<li>Ramamurthy RM, Atala A, Porada CD, Almeida-Porada G. Organoids and microphysiological systems: Promising models for accelerating AAV gene therapy studies. Front Immunol. 2022;13:1011143.</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

본 연구에서는 AAV 개발 및 역가 시험을 위한 효율적인 in vitro&#160;3D 플랫폼을 제시합니다. 이 플랫폼은 인간 조직 구조와 더 유사한 3차원 세포 배양을 통해 향상된 형질도입, 높은 민감도 및 더 나은 중개 예측 가능성을 활용합니다. 이 시스템은 여러 세포주에서 단일 가닥 및 자가 보완 벡터를 포함하여, AAV 혈청형 및 조절 요소에 따른 형질도입 효율의 차이를 성공적으로 구분해 냅니다. 형질도입 효율을 흔히 외래유전자 양성 세포의 백분율로 정의하는 기존의 2D 분석법과 달리, 3D 스페로이드 시스템은 단일 세포 해상도의 정량이 용이하지 않다는 점에 주목하십시오. 따라서 본 연구에서 형질도입 효율은 전체 리포터 신호 강도(형광 또는 발광)로 정의하며, 이는 형질도입된 세포의 비율과 세포당 외래유전자 발현 수준의 결합된 기여도를 반영합니다. 스페로이드의 높은 민감도는 제품의 대량 사용 필요성을 상당히 낮추어, AAV 연구 및 개발에 있어 비용 효율적이고 다각적이며 생리학적으로 유의미하게 작용합니다.
이러한 접근 방식은 인공 표면으로의 부착에 의존하며 세포 조직화가 결여되어 발생할 수 있는 기존 2D 세포 배양 분석의 주요 문제점들을 해결합니다.&#160;이는 임상 환경에서 벡터 성능에 대한 예측력이 떨어지는 결과로 이어집니다. 3D 스페로이드 시스템은 조직 구조와 약물 분포 패턴을 더 잘 모사하여, 실제 생물학적 조건과 더 밀접하게 일치하는 벡터 거동 데이터를 제공합니다.22,23본 프로토콜은 단순한 초저부착 플레이트를 사용하므로 표준 실험실 환경에서 쉽게 재현할 수 있습니다.
이 적응형 시스템은 AAV 중화 분석, AAV 침투 연구, 그리고 다양한 세포 환경이 AAV 형질전환에 미치는 영향을 조사하기 위한 더욱 복잡한 공배양 실험 개발에 활용될 수 있습니다. 또한, 고처리량 약물 및 벡터 스크리닝 플랫폼을 스페로이드 플랫폼과 쉽게 통합할 수 있어, 보다 표적화된 제품 개발을 위한 벡터 발굴 워크플로우의 자동화와 비용 절감이 가능합니다.
스페로이드의 주요한 실질적 장점은 세포 계대 배양 없이 수주 동안 지속적으로 성장할 수 있어, AAV 활성에 대한 장기적인 연구가 가능하다는 점입니다. 이러한 안정적인 배양 시스템은 중요한 세포 간 상호작용과 매트릭스 구성 요소를 유지하며, 2D 배양에서 필요한 반복적인 세포 수확으로 인한 중단을 방지합니다24. 이렇게 보존된 세포 환경은 AAV의 세포 결합 및 침투를 평가하는 데 필수적인 천연 단백질 조직과 막 구조를 지원합니다25.
3D 스페로이드는 AAV 형질전환 평가에 있어 큰 가능성을 보여주지만, 천연 조직에 비해 구조가 단순하다는 점 때문에 in vivo&#160;모델과 비교했을 때 몇 가지 중개적 단점이 있습니다. 스페로이드는 벡터 전달을 위한 혈관 체계, 면역원성 평가를 위한 면역 세포, 그리고 혈뇌장벽과 같은 조직 특이적 장벽 등 AAV 성능에 상당한 영향을 미칠 수 있는 핵심적인 생리학적 구성 요소가 부족합니다26. 이러한 한계는 스페로이드가 기존의 2D 배양과 in vivo 동물 모델 사이의 중간 수준의 복잡성을 제공함에도 불구하고, 포괄적인 AAV 평가에 필요한 생리학적 미세환경을 완전히 재현하기에는 여전히 불충분함을 시사합니다.
여기에서 제시하는 스페로이드 프로토콜은 한 번에 단일 세포 유형을 다룹니다. 이 프로토콜은 기본적인 3차원 구조로 응집되는 2~3가지의 추가 세포 유형을 포함하도록 발전시킬 수 있습니다. 오가노이드나 미세유체 장치와 같은 더 복잡한 3D 모델은 특정 기관의 세포 다양성과 조직 구성을 재현하는 다세포 시스템으로, 조직과 유사한 패턴으로 배열된 10가지 이상의 서로 다른 세포 유형을 포함합니다. 이러한 고급 3D 오가노이드는 다중 세포27, 하이드로겔 내장 배양, 현수 적하(hanging drop) 기술 및 미세유체 플랫폼11,27,28을 포함할 수 있습니다. 이러한 방법들은 AAV 생물학에 대한 이해를 넓히는 데 도움이 될 수 있는 더 복잡한 조직 구조를 제공하지만, 더 전문적인 시약과 장비, 그리고 상당한 기술적 전문 지식이 필요한 경향이 있습니다. 반면, 초저부착 플레이트에서 형성된 3D 스페로이드는 상당히 더 간단하며, 비용 효율성과 재현성이 뛰어나 많은 연구실에서 사용하기에 적합합니다.
본 프로토콜을 성공적으로 구현하기 위한 핵심 단계에는 높은 세포 생존율 유지 과정이 포함되며, 이는 세포 상태가 나쁠 경우 스페로이드 형성 및 형질전환 효율이 저하될 수 있기 때문입니다. 또한, 초저부착 플레이트의 사용과 원심분리 조건의 최적화는 스페로이드의 밀집도를 높이는 데 매우 중요합니다. 약한 신호나 포화를 방지하기 위해 각 세포 유형 및 AAV 혈청형에 맞는 MOI를 최적화하는 것이 필수적입니다. 적절한 검출 방법을 선택하는 것 또한 중요하며, 특히 연속 실시간 세포 이미징 시스템과의 호환성이 요구되는 키네틱 분석의 경우 더욱 그러합니다. 3D 스페로이드에서의 AAV 형질전환을 정확하게 해석하기 위해 몇 가지 기술적 고려 사항이 중요합니다.
형질전환 신호가 낮거나 나타나지 않는 경우는 낮은 바이러스 역가, 최적화되지 않은 MOI 또는 불충분한 배양 시간으로 인해 발생할 수 있으며, 이는 바이러스 역가를 검증하고 MOI를 최적화하며 배양 시간(통상 3–5일)을 연장함으로써 해결할 수 있습니다. 약한 형광 또는 발광 신호는 낮은 트랜스진 발현이나 3D 구조 내의 제한적인 시약 침투를 반영할 수 있으며, 이는 노출 설정을 최적화하거나 기질 확산에 필요한 추가 시간을 확보함으로써 개선될 수 있습니다. HeLa 세포와 같은 특정 세포주에서의 주요 과제는 자가형광으로, 이는 형광 기반 분석에서 높은 배경 신호와 민감도 저하를 초래할 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 본 연구에서는 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio)가 개선되고 자가형광 배경에서도 더 정확한 형질전환 검출이 가능한 발광 기반 nanoluciferase 리포터 시스템을 구현하였습니다. 또한, 배경 신호는 부적절한 임계값 설정이나 배지 관련 형광으로 인해 발생할 수 있으므로, 처리하지 않은 웰(MOI = 0)을 사용하여 기저 수준을 정의함으로써 이를 제어해야 합니다. 마지막으로, 높은 MOI에서 발생하는 신호 포화는 과도한 바이러스 투입이나 검출기 한계로 인해 나타날 수 있으며, 이는 MOI 범위를 줄이고 검출기 노출 설정을 최적화하여 측정값이 선형 동적 범위(linear dynamic range) 내에 유지되도록 함으로써 완화할 수 있습니다.
종합적으로, 이 3D 스페로이드 방법론은 AAV 형질도입, 효능 및 역동성을 평가하기 위한 효율적이고 재현 가능한 시스템을 제공합니다. 기존의 2D 분석법과 in vivo 연구 사이의 간극을 메움으로써, 보다 정보에 기반한 벡터 개발을 가능하게 하며 임상적으로 유의미한 유전자 치료 전략의 발전을 뒷받침합니다.

AAV 벡터는 안전성 프로필과 지속적인 유전자 발현 달성 능력 덕분에 in vivo 응용 분야에서 선호되는 유전자 전달 시스템 중 하나가 되었습니다1. AAV 유전자 치료는 수백 개의 제품이 개발 파이프라인에 있을 정도로 여러 희귀 질환 적응증 치료에서 성공을 거두고 있습니다2. 또한, Cas9과 같은 게놈 편집 구성 요소의 in vivo 전달을 포함한 신규 응용 분야는 치료가 어려운 적응증의 치료를 돕는 데 큰 잠재력을 가지고 있습니다3. 주요 개발 과제로는 높은 제조 비용과 제품 품질 및 임상 효능을 결정하는 현재의 in vitro 분석법의 제한적인 예측 능력이 있습니다4.
AAV 치료제의 발전은 임상적 성능을 정확하게 예측할 수 있는 예측 가능하고 표준화된 활성 분석법의 부재로 인해 근본적인 제약을 받고 있습니다4,5. 이러한 분석법은 엔지니어링된 벡터 라이브러리 스크리닝, 표적성 향상을 위한 캡시드 수정 최적화, 조직 특이적 친화도 평가 등 다양한 목적으로 사용되므로 개발 파이프라인의 핵심 구성 요소가 됩니다. 또한, 조절 서열이 트랜스진 발현에 미치는 영향을 규명하는 데에도 활용됩니다6. 후보 물질 선정 외에도, AAV 형질전환 분석법은 로트 출시, 로트 비교 연구 및 안정성 평가에 사용되는 역가 시험을 통해 제조 공정의 중요한 품질 관리를 지원합니다6,7.
과학적 과제는 일상적인 사용을 위한 실용적인 가능성을 유지하면서 벡터-숙주 상호작용의 복잡성을 포착하는 분석법을 개발하는 것입니다7,8. 현재의 접근 방식에는 전통적인 2D 단층 배양에서 표적 장기를 나타내는 불멸화 세포주를 활용하는 것이 포함됩니다. 이러한 배양 조건은 생리학적 관련성이 부족하며 높은 약물 용량을 필요로 합니다. 이는 실험실의 예측과 임상 적용 가능성 사이에 상당한 격차를 유발합니다. AAVR을 과발현하거나 CRISPR로 활성화된 시스템과 같은 새로운 엔지니어링 세포주는 중요한 진전을 나타내지만, 천연 조직의 특성인 3차원 구조와 세포외 기질 상호작용을 재현하는 데는 실패했습니다9,10,11. in vivo 미세환경을 더 잘 모사하는 차세대 모델은 이러한 중개적 격차를 메울 수 있을 것입니다12,13,14.
당사는 최근 AAV 형질전환 분석의 전이 가능성을 높이기 위해 AAV 형질전환에 최적화된 3D 스페로이드 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 표준 2D 분석법과 비교하여 여러 세포주와 AAV 혈청형 전반에서 AAV 형질전환 효율을 유의미하게 향상시킵니다. 분석에 사용되는 제품의 보존성과 민감도가 향상되었을 뿐만 아니라, 이 모델들은 스페로이드 내 세포 위치에 따라 달라지는 실제적인 세포 간 상호작용을 제공함으로써 2D 단층 배양보다 개선된 환경을 제공합니다. 또한 실제 장기 조건을 모사하여 약물 침투에 대한 유의미한 조사를 가능하게 합니다11,15,16. 나아가, 이 스페로이드 접근법은 표준 실험 장비를 사용하며 특수 배지나 스캐폴드 요구 사항이 없어, 더 복잡한 오가노이드 또는 공동 배양 시스템보다 실무적인 이점을 제공합니다. 이러한 단순성은 재현성과 확장성을 보장하여, 일상적인 유전자 치료제 테스트 및 벡터 개발 워크플로우에 매우 적합합니다17.
이 3D 스페로이드 플랫폼은 저용량에서의 AAV 형질전환에 대한 민감한 검출과 벡터 게놈 설계의 비교 평가가 필요한 응용 분야에 특히 적합합니다. 또한 혈청형 의존적 친화성(tropism) 평가도 지원합니다. 특히 기존의 2D 배양에서는 높은 AAV 용량이 필요했던, 형질전환 효율이 상대적으로 낮은 세포주에 매우 유리합니다. 이러한 상황에서는 3D 플랫폼의 향상된 민감도와 개선된 생리학적 관련성이 매우 중요합니다. 하지만, 면역 성분, 혈관 전달 또는 전체 조직의 복잡성이 필요한 연구에는 이 시스템이 덜 적합할 수 있습니다. 이는 스페로이드가 in vivo&#160;환경을 완전히 재현하지는 못하기 때문입니다.
따라서 본 연구에서는 두 가지의 결정적이고 상호 보완적인 판독 값인 형질전환 효율(여기서는 스페로이드당 총 리포터 신호로 정의)과 형질전환 역학을 통해, AAV 형질전환 분석에 최적화된 간편한 3D 스페로이드 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 AAV 효능 평가, 벡터 설계 및 중화 분석을 위해 비용 효율적이며 생리학적으로 관련성이 높고 유용한 플랫폼을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>37°C 인큐베이터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#51025983</td><td>표준 배양 조건</td></tr><tr><td>A375 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-1619</td><td>세포주</td></tr><tr><td>AAV1 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>112862</td><td>AAV 플라스미드</td></tr><tr><td>AAV2 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>104963</td><td>AAV 플라스미드</td></tr><tr><td>AAV5 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td>AAV 플라스미드</td></tr><tr><td>AAV8 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>112864</td><td>AAV 플라스미드</td></tr><tr><td>AAV9 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td>AAV 플라스미드</td></tr><tr><td>BioTek GEN5 플레이트 리더</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>형광 또는 발광 엔드포인트 측정</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#TSO-MX1R</td><td>스페로이드 현탁액 유지</td></tr><tr><td>Corning&amp;trade; 세포 배양용 인산염 완충 식염수 (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MT21040CMX</td><td>세포 세척용 PBS</td></tr><tr><td>DMEM high glucose, GlutaMAX 보충제, pyruvate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#10569010</td><td>완전 성장 배지</td></tr><tr><td>세포 외 NanoLuc 억제제&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N235B</td><td>세포 외 환경에서 발생하는 모든 Nanoluc&amp;reg; 신호를 소광함&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>소태아 혈청 (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F4135-500mL</td><td>성장 인자 제공</td></tr><tr><td>HEK293T 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>세포주</td></tr><tr><td>HeLa 세포</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td>세포주</td></tr><tr><td>HEP3B 세포</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td>세포주</td></tr><tr><td>HEPG2 세포</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>세포주</td></tr><tr><td>Huh7 세포</td><td>ABM</td><td>T8973</td><td>세포주</td></tr><tr><td>IncuCyte S3 도립 현미경</td><td>Sartorius</td><td>NA</td><td>스페로이드 형성/성장 모니터링</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum 이미저</td><td>Spectralinvivo</td><td>NA</td><td>발광 엔드포인트 측정</td></tr><tr><td>Nano-Glo&amp;reg; 생존 세포 분석 키트&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N2013</td><td>생존 세포 검출을 위한 발광 기질 시약</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td>박테리아 오염 방지</td></tr><tr><td>통기성 T75 조직 배양 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>#NC0509296&amp;nbsp;</td><td>세포 배양용 플라스크</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#25300120</td><td>세포의 효소적 분리</td></tr><tr><td>초저부착 플레이트</td><td>Corning</td><td>#7007</td><td>세포 부착을 방지하여 스페로이드 형성 촉진</td></tr></tbody></table>

aav 형질도입 연구를 위한 3d 스페로이드 평가

Evaluation of 3D Spheroids for AAV Transduction Studies

아데노 부속 바이러스(AAV)는 유전자 치료제에서 유전자 전달에 사용되는 강력한 벡터입니다. AAV 개발에는 벡터 설계, 혈청형 성능, 조절 요소 강도 및 발현 키네틱스의 차이를 안정적으로 검출할 수 있는 in vitro&#160; 시스템이 필요합니다. 이러한 시스템은 역가 평가 및 벡터 최적화와 같은 응용 분야도 지원해야 합니다. 본 논문에서는 다양한 세포주에 걸쳐 AAV 역가, 트랜스진 발현 키네틱스 및 혈청형 특이적 형질전환 효율을 평가하는 데 최적화된 간소화된 3차원 스페로이드 플랫폼을 설명합니다. 초저부착 플레이트를 사용하여 균일한 스페로이드를 생성하며, 안정적인 구조와 장기 이미징을 지원하는 조건에서 유지합니다. AAV 형질전환 후, 라이브 세포 이미징 시스템을 사용하여 형광 또는 발광 리드아웃을 실시간으로 모니터링합니다. 이를 통해 연속적인 키네틱스 이미징으로 리포터 신호, 용량 반응성, 조절 요소 활성 및 발현 시작 시간을 정량적으로 평가할 수 있습니다. 이 플랫폼은 강력한 벡터 게놈 설계와 약한 설계를 효과적으로 구별하며, 여러 AAV 혈청형 간의 차이도 판별합니다. 이 방법은 느리게 분열하는 세포주와 빠르게 분열하는 세포주 모두에서 견고한 성능을 보여줍니다. 이러한 결과는 이 시스템이 전임상 유전자 치료 평가 및 개발을 위한 확장 가능하고 생리학적으로 유의미한 시스템으로서 유용함을 입증합니다.

3차원 스페로이드 배양 시스템은 AAV 유전자 치료제 개발을 위한 기존의 2D 모델을 개선한 방식입니다. 이 방법론을 통해 저용량에서의 AAV 형질전환을 민감하게 검출할 수 있으며, 생리학적 관련성을 높이고 견고한 장기 모니터링이 가능합니다. 이 플랫폼은 다양한 세포주와 AAV 혈청형에 걸쳐 효능 평가, 고속 스크리닝 및 벡터 최적화를 지원합니다.

AAV 형질도입 연구를 위한 3D 스페로이드 평가

아데노-연관 바이러스(AAV)는 유전자 치료제에서 유전자 전달에 사용되는 강력한 벡터입니다. AAV의 개발에는 ... 하는 인비트로(in vitro) 시스템이 필요합니다.

We developed a sensitive, physiologically relevant 3D spheroid platform to evaluate AAV transduction activity and improve the prediction of vector performance for gene therapy. This protocol is applicable for evaluating AAV activity in vector potency testing, serotype screening, transgene optimization, neutralization studies, and in vitro preclinical gene therapy.To start, grow the cells in a T75 cell culture flask until they reach 70% confluency under standard conditions. After trypsinizing the cells, prepare a 1 to 10 dilution for routine cell passaging. Incubate the cells again until they reach 70% confluency, then harvest them. After assessing cell viability, thoroughly pipette the cell suspension to ensure it is well mixed. Perform two-fold serial dilutions of the cells in an ultra-low attachment 96-well plate, starting with 1 times 10 to the power of 4 cells per well in 200 microliters. Following the experimental layout shown, add 1 volume of complete medium to all rows except the top row. Then add two volumes of 1 times 10 to the power of 4 cells per well in the top row. Serially dilute row 1A by adding one volume of row 1A into row 1 B, and continue in the same manner. Centrifuge the ultra-low attachment plate at 350 x g for five minutes to pull the cells to the center and promote cell-to-cell contact. Incubate at 37 degrees Celsius, undisturbed for 24 to 48 hours for spheroid formation. Allow three days for the diameter to reach about 400 micrometers. Check spheroid size uniformity, ensuring cells are resuspended evenly and plates are flat. Monitor spheroid morphology. Select mature spheroids that exhibit tight cell-to-cell adhesion rather than loose cell aggregates.Once the cell suspensions are spun down, transfer the plate to a 37 degrees Celsius incubator equipped with a live-cell imaging instrument. Log in to the acquisition software. Select Schedule to acquire and Scan on schedule, then select Create vessel to New. Then choose scan type and select spheroid. Pick the channels of interest. Select phase with bright field. Then choose green or red. Set the desired magnification to 10x. Pick the plate model and its position in the drawer. Select the wells to image and enter the experiment name. For the analysis setup, select Differ analysis until later. Set scans to be added every six hours and scan indefinitely. Check daily for spheroid growth by logging into the imaging software. Select View recent scans and double-click on the desired experiment. After selecting Brightfield in the image channels panel, use the Measure image feature to measure the diameters of the spheroids. Remove the plate on the day of optimized spheroid formation and use it for adeno-associated virus, or AAV, transduction.Prepare a 96-well round bottom plate containing 297 microliters of 2% FBS-supplemented DMEM without antibiotics. Add 33 microliters of AAV stock to the medium to obtain a starting multiplicity of infection, or MOI, of 1 times 10 to the power of 6. Then prepare 10-fold serial dilutions by transferring 33 microliters of each dilution into 297 microliters of medium. Aspirate all medium from the previously prepared spheroid plate using a multichannel pipette. Transfer 100 microliters of the desired MOI of AAV from the dilution plate to the treatment plate using a multichannel pipette. Place the plates back into the imaging instrument. Start monitoring transduction by tracking green fluorescent intensity over 72 hours. Add 100 microliters of complete DMEM per well every three days to replenish nutrients. Place the plate back in the imaging instrument and start recording transduction efficiency every six hours. Analyze the data by creating an analysis definition specific to the cells and reporter genes of interest. Perform endpoint analysis using fluorescence readouts. Similarly, perform AAV transduction in 3D spheroids with luminescent reporters, followed by transduction analysis using bioluminescent imaging.Each cell line exhibited distinct morphological features and varying levels of compaction after three days of seeding. Hepatic cell lines formed more compact, denser spheroids than other cell lines. HEK293T formed a very round spherical appearance with a distinct necrotic core. A375 formed an irregularly shaped cell aggregate. Spheroids were highly susceptible to AAV transduction, with strong transduction detected at very low AAV titers across different cell lines for self-complementary GFP. Spheroid transduction of single-stranded GFP was observed at lower levels than self-complementary GFP. A 100-fold difference in relative fluorescence was observed between the self-complementary and single-stranded transgenes at a MOI of 10 to the power of 6 in HEK293T cells. A three-fold difference in relative fluorescence was observed between the self-complementary and single-stranded transgenes in HEP3B cells. All four AAV serotypes were successfully detected using both the fluorescent plate reader and the live-cell imaging system. AAV2 showed the highest transduction efficacy, followed by AAV1 in both cell lines. All AAV serotypes showed efficient transduction using the luminescent system, enabling precise differentiation of transduction efficacy. AAV2 was the most effective serotype in HeLa spheroids, while AAV9 had the lowest transduction efficacy. AAV2 self-complementary GFP transduction was detectable at infection rates as low as 10 to the power of 1, with a noticeable increase in signal after about 34 hours compared to untreated cells. The AAV2 single-stranded GFP signal was weaker and slower than the self-complementary GFP signal.The key challenge when performing this protocol is maintaining high cell viability, producing uniform, compact spheroids, and optimizing AAV dosing for each cell type and serotype. This protocol can assess transgene expression and functionality using RT-qPCR, Western blotting, ELISAs, and somatic activity assays, and onset time kinetic analysis. Future studies can incorporate co-cultures, organoids, microfluidics, immune cells, or vasculature to better mimic the in vivo microenvironment.

evaluation-of-3d-spheroids-for-aav-transduction-studies

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서에서는, 우리는 인간 간암 세포를 타겟팅하는 가장 효율적인 벡터로 adeno - 관련 바이러스 혈청형 3 (AAV3)의 신분증을 설명합니다.

재조합 Adeno - 관련 바이러스 혈청형 3 벡터에 의해 간암 세포의 고효율 전달

우리는 molecularly 유전자 가족 걸어갔다 통해 합성 Adeno-관련 바이러스 (AAV) 유전자 치료 벡터를 엔지니어이며 진화하는 기본적인 기법을 보여줍니다. 더욱이, 우리는 선택과 문화 혹은 생쥐의 표적 세포에 대한 향상된 특성을 가진 각각의 키메라 capsids의 분석을위한 일반 지침 및 대표 예제를 제공합니다.

유전자 가족 걸어갔다 통해 공학 및 합성 Adeno-관련 바이러스의 진화 (AAV) 유전자 치료 벡터

망막 질환의 동물 모델에서 혈액-망막 장벽 투과성과 내부 제한 막 무결성을 조사하기 위해 여러 아데노 관련 바이러스(AAV) 변종을 망막 뉴런과 신경교세포를 라벨링하는 도구로 사용했습니다. 그런 다음 바이러스 매개 리포터 유전자 발현을 망막 장벽 투과성의 지표로 사용합니다.

도구로 아데노 관련 바이러스를 사용하여 질병 망막 장벽을 연구하는

여기, 우리가 생산 하는 효율적이 고 재현 가능한 전략, titer, 및 품질 관리 일괄 adeno 관련 바이러스 벡터의 설명 합니다. 그것은 높은 titer로 벡터 준비를 하면 (13 벡터 게놈/10ml x ≥1)와 고 순도, 생체 외에서 또는 vivo에서 사용에 대 한 준비.

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

이 방법은 형광 태그 sarcomere 단백질을 가진 다능한 줄기 세포 유래 심근세포를 사용하여 sarcomere 단축을 검사하는 것을 이용할 수 있습니다.

형광 태그 사코레 단백질을 사용하여 다능줄기 세포 유래 심근 세포의 Sarcomere 단축.

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

여기에서 현탁액 HEK293 셀 기반 AAV 생산 프로토콜이 제시되어 상용 공급업체에서 연구 목적으로 사용할 수 있는 구성 요소를 사용하여 벡터 생산에 필요한 시간과 노동력을 줄일 수 있습니다.

HEK293 부유 세포를 사용한 고수율 Adeno 관련 벡터 배치 생산

이 원고는 최적화된 헤파린 기반 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하여 아데노 관련 바이러스 벡터의 생성 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 간단하고 확장 가능하며 비용 효율적인 접근 방식을 제시하여 초원심분리가 필요하지 않습니다. 생성된 벡터는 높은 순도와 생물학적 활성을 나타내며 전임상 연구에서 그 가치를 입증합니다.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

여기에서는 성체 마우스에서 아데노 관련 바이러스(AAV)를 체계적으로 투여하기 위해 마우스 측면 꼬리 정맥 주입에 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 또한 AAV transduction을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.

성체 마우스에서 측면 꼬리 정맥 주입을 통한 아데노 관련 바이러스의 일관된 전달

이 보고서는 마우스 신장으로의 효과적이고 안전한 유전자 전달을 위해 신우 를 통한 AAV 벡터의 국소 주입 방법을 자세히 설명합니다.

아데노 관련 바이러스 벡터의 느린 역행 신골 주사 를 통한 마우스 신장에 효과적이고 안전한 유전자 전달

배우세요 AAV 형질도입 연구를 위한 3D 스페로이드 평가 방법을 통해 유전자 치료 벡터의 효능과 형질 발현 동역학을 정량적으로 분석하는 기술을 익히세요. 이 플랫폼은 다양한 세포주에서 혈청형 특이적 형질도입 효율을 평가할 수 있습니다.

AAV 형질도입 연구를 위한 3D 스페로이드 평가

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