냉동 버피 코트 샘플에서 유도된 다능성 줄기세포주 재프로그래밍

이 프로토콜의 목적은 인간의 냉동 버피 코트(PBMC)를 유도 다능성 줄기세포로 재프로그래밍하는 것입니다. 이 프로토콜은 해동 후 버피 코트를 독특하게 정제하고, 재프로그래밍 성공을 나타내는 체세포 형태를 식별합니다. 먼저, 인간의 피에서 추출한 얼어붙은 버피 코트를 꺼내 얼음 위에 올려두세요.

샘플을 37도 섭씨 물에 부드럽게 휘저은 후 작은 얼음 결정만 남으면 바이알을 꺼냅니다. 바이알 내용물을 조심스럽게 떨어뜨리며 12밀리리터 DPBS가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. DPBS 1밀리리터로 바이알을 헹군 후, 채취한 세포가 들어 있는 원뿔형 튜브에 세척액을 넣으세요.

샘플을 실온에서 200g 압력으로 10분간 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 제거하고, 세포 펠릿을 1%FBS가 함유된 DPBS 4밀리리터에 재현탁합니다. 다음으로, 버피 코트 혼합물을 밀도 구배 용액 3밀리리터 위에 부드럽게 층층이 쌓아 경계면에서 섞이지 않도록 합니다.

800g의 스윙잉 버킷 로터를 실온에서 브레이크를 해제한 상태로 20분간 원심분리기. 피펫을 사용해 상부 플라즈마 층을 제거하고 폐기하면, 플라즈마와 그라디언트 인터페이스를 방해하지 않습니다. 그 후 경계면에서 말초 혈액 단핵세포 또는 PBMC 층을 제거하여 깨끗한 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.

PBMC는 팽창 매체 3밀리리터를 넣고 200g에서 실온에서 10분간 원심분리하여 세척하세요. 상청액을 조심스럽게 제거하고 SCF, IL-3, EPO, IGF-1 등 사이토카인이 포함된 팽창 배지 2밀리리터에 펠릿을 재현탁합니다. 셀을 12웰 플레이트 중 1웰에 도금합니다.

세포를 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 20% 산소에 10일에서 14일간 배양합니다. 매질의 절반을 이틀에 한 번씩 교체하여 밝고 둥근 적혈반세포가 밀집된 개체군이 관찰될 때까지 반복하며, 이는 세포가 전도할 준비가 되었음을 나타냅니다. 야마나카 인자를 가진 센다이 바이러스로 전달한 지 3일 후, 세포를 마우스 배아 섬유아세포에 웰당 2밀리리터씩 플레이트합니다.

배양을 약 7일간 인큐베이팅하며, 이틀에 한 번씩 hESC 매개체를 공급합니다. 형질전환된 세포와 출현된 집락이 담긴 플레이트를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 현미경을 사용해 한 군집을 찾아 플레이트 뚜껑을 들어 올려 우물을 노출시킵니다.

무균 상태로 주사기를 열고 바늘을 노출하세요. 현미경의 안내를 받아 바늘 끝으로 집락의 윤곽을 따라 주변 피더 세포에서 집락을 분리합니다. 바늘 끝으로 군집을 몇 개의 같은 크기로 잘라내세요.

조각들이 분리되지 않았다면, 바늘 옆면을 사용해 접시에서 떠서 떠 있을 때까지 긁어내세요. 이제 P200 피펫을 사용해 현미경 아래에서 뽑은 콜로니를 찾아내고, 피펫으로 플로팅 콜로니를 흡입한 뒤, 준비된 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 다른 집단이나 피더 셀을 수집하지 않고 전체 집단을 옮기도록 하세요.

플레이트를 37도 섭씨에 넣고 5% 이산화탄소와 20% 산소를 넣어 원하는 수합 지점이 될 때까지 보관합니다. 크고 둥글며 빛나는 가장자리를 가진 군체는 분열 준비가 된 것으로 식별하세요. 우물에서 배지를 흡입한 후 1밀리리터 DPBS로 샘플을 한 번 헹군습니다.

그 다음 DPBS를 제거하고 0.5밀리몰라 EDTA 해리 완충액 500마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 2분간 배양하여 군집이 느슨해지고 세포가 모일 때까지 보관합니다. 다음으로 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 EDTA 해리 완충액을 흡인합니다.

P1000 피펫을 사용해 1밀리리터 인간 다능성 줄기세포 배지를 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 콜로니가 분리되고 약간 부서질 때까지 세포를 채취합니다. 1밀리리터의 배지와 세포를 새로운 6웰 플레이트에 옮기고, 그 배지는 1밀리리터의 신선한 인간 다능성 줄기세포 배지를 포함합니다. 세포를 37도 섭씨에 넣고, 이산화탄소 5%, 산소 20%를 넣어 보관합니다.

우물이 합쳐져 분할 준비가 될 때까지 매일 유도 다능성 줄기세포를 공급하세요. 한편, 10cm 접시에 DPBS에서 5마이크로그램당 밀리리터 비트로넥틴 용액 7밀리리터를 코팅하고 실온에서 1시간 배양합니다. 분할을 계속하려면 10cm 접시에 7에서 10밀리리터의 인간 다능성 줄기세포 배지를 추가하고, 6웰 플레이트에서 접시로 세포를 1:1 비율로 옮긴 뒤, 앞서 보인 대로 배양합니다.

10cm 접시 내 세포들이 합류하는지 확인한 후 다시 세포를 분리하세요. 세포 형태와 밀도에 따라 분할 비율을 조정하며, 보통 1:10 비율을 사용하고, 각 통과 지점의 통과 번호를 기록합니다. 마지막으로, 면역형광을 이용해 줄기성 마커 NANOG 발현을 확인하여 유도 다능 줄기세포를 특성화합니다.

정의된 배양 조건을 사용하여 세포를 외배엽, 중배엽, 내배엽 계통으로 분화합니다. PAX6, Brachyury, SOX17 염색과 NANOG 발현 상실을 통해 분화 가능성을 평가합니다. 확장이 끝날 때 PBMC는 밝고 둥근 크기의 크고 작은 세포로 나타나는 적혈구세포로 분화했습니다.

반면, 이러한 세포가 없거나 죽은 것처럼 보이는 배양은 성공적으로 재프로그래밍될 가능성이 낮았습니다. 성공적인 전이도와 재프로그래밍은 방사선 피더 세포에서 유도된 다능성 줄기세포 집단의 출현으로 특징지어졌으며, 이들은 전형적인 줄기세포 형태를 발전시켰다. 반면, 줄기세포와 유사한 형태를 채택하지 않은 세포는 성공적으로 재프로그래밍되지 못했습니다.

성공적으로 재프로그래밍된 유도 다능성 줄기세포는 매끄럽고 밝은 가장자리를 가진 조밀하고 둥근 군락을 보였다. 자발적 분화나 조밀한 중심과 같은 덜 이상적인 형태를 가진 아클론은 분할 조건을 조정하여 정화했다. 일부 선정된 식민지는 성공적으로 확장하지 못했습니다.

형태학 외에도, 유도된 다능성 줄기세포는 줄기성 마커 NANOG의 발현으로 입증되어 줄기성을 보였습니다. 재프로그래밍된 유도 다능성 줄기세포는 외배엽, 중배엽, 내배엽으로 분화 가능성을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 재프로그래밍 성공을 추적하고 예측할 수 있는 상세한 체크포인트를 제공합니다.

iPSC 라인이 사용 적합한지 추가로 확인하기 위해 핵형 분석, 유전자형 분석 및 정기적인 마이코플라즈마 검사가 시행되어야 합니다. 이 프로토콜은 바이오뱅크 버피 코트를 가진 기존 환자 집단에서 재프로그래밍을 가능하게 하여 iPSC 기술의 활용도를 넓혀줍니다.