용액 NMR을 이용해 이상성 조건에서 생체분자 응축액을 특성화하기

우리는 생체분자 응축체를 연구하기 위한 NMR 방법을 개발했습니다. 이들은 세포 조직에 핵심적이지만, 여러 질환에서 그 모든 정보가 암시되어 있습니다. 저희 방법을 통해 응축수 물질의 특성을 조사하고, 그 형성 메커니즘을 분석하며, 응축수 성숙이나 생체분자의 병리적 세동과 같은 장기적 변화를 모니터링합니다.

먼저, 아가로스 하이드로겔로 안정화된 최종 이상 샘플을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관 내에서 단백질 스톡, RNA 스톡 또는 둘 다 따뜻한 아가로스 버퍼와 혼합하여 준비합니다. 최종 단백질 또는 RNA 농도는 일반적으로 NMR 검출을 위해 50에서 500 마이크로몰라입니다. 준비된 이상 샘플을 분광기에 삽입한 후, 평소처럼 프로톤 채널을 잠그고, 심하며, 매칭하고 조율합니다.

일반 보정 절차를 사용하여 양성자 채널의 90도 펄스 길이를 보정합니다. 그 다음 1차원 수분 억제 스펙트럼을 기록하고 그 스펙트럼에 강한 생체분자 신호가 포함되어 있는지 확인한다. 신호가 전혀 없거나 매우 적으면 REDIFINE을 사용하지 말고 CONDENSE-MT를 사용하세요.

확산 순서 분광 실험을 기록하여 확산 구배 세기를 2%에서 95%까지 16단계로 배열합니다. 전체 REDIFINE 세트의 데이터를 계속 수집하려면, 방금 실행된 초기 실험의 매개변수를 복사하여 9개의 새로운 단계 PPP GPQ S19 실험을 생성하세요. 각 연속 실험에서는 D20 확산 지연만 가변적으로 변경하여 100에서 1000밀리초 사이를 넓히도록 합니다.

이 모든 실험을 적절한 명령어로 실행하세요. 마지막 N을 사용해 10번의 실험 동안 수신기 게인을 유지하세요. Q Sign을 창 기능으로 SSB2로 설정하세요.

그 다음 적절한 명령어를 사용해 다섯 번째 조각을 추출합니다. 1차원 스펙트럼을 위상화하고 위상 파라미터를 2차원 데이터셋에 저장하세요. XF2로 2차원 데이터셋을 처리하고 ABS2로 기준선 보정을 수행합니다.

그 다음, 분할 2D로 16개의 슬라이스를 추출하세요. 나머지 9개의 실험에도 비슷한 절차를 반복하세요. 정확한 위상과 기준선 보정을 위해 적어도 처음 네다섯 조각은 꼭 확인하세요.

필요하다면 위상과 기준선을 수동으로 보정하세요. 그 다음 적절한 MATLAB 코드를 사용해 분석하세요. 코드에서 확산 시간을 수정하고, 프로브 구배 강도에 따라 PG 값을 설정하며, 총 실험 수를 기준으로 1부터 10까지 실험을 할당하세요.

그 후 이 코드를 사용하여 REDIFINE 모델에 맞춰 데이터를 적합시킵니다. 1차원 물 억제 스펙트럼을 기록하세요. 신호가 매우 적으면 CONDENSE-MT 실험을 진행하세요.

정량적 CONDENSE-MT를 위해 T1 역전 회복을 통해 물의 R1 속도를 산출합니다. 제공된 펄스 시퀀스와 VD 목록을 해당 폴더에 복사하세요. 양성자 90도 펄스를 보정한 후, NS를 2, DS를 0, D1을 20초, SW를 10ppm으로 설정했습니다.

TD2에서 16K까지, TD1에서 24마일까지. CONDENSE-MT 실험의 경우, 제공된 Bruker 매개변수 집합, 서열, 빈도 목록을 Bruker 전용 폴더에 복사하세요. 그 다음 분광기에 따라 주파수와 출력을 조정하세요.

P1은 보정된 90도 펄스 길이로, P4는 여기 펄스로 1마이크로초로 설정하여 방사선 감쇠를 피하세요. NS를 2, DS를 16, D1을 4초, SW2를 20ppm, TD2를 8k, TD1을 주파수 목록 길이로 설정하세요. SPNAM10 Squa100, 000으로 설정하고, P10을 5초로 설정하세요.

100헤르츠 방사선을 제공하는 SP10 전력을 찾아보세요. 그에 맞게 조사 펄스의 SP10 출력을 조정하세요. 적절한 명령어로 의사 2차원 실험을 실행하고, SP10 조사 전력을 변화시키는 일련의 유사 2D 실험을 설정하세요.

모든 매개변수를 조정한 후, 코드를 실행해 NMR 스펙트럼을 읽으면, 물 신호를 통합해 새로운 변수로 저장합니다. 코드 반전 복구에서 적절한 데이터로 경로를 조정하고 물 통합 영역을 점검하세요. 그 다음 역전 회복 데이터가 포함된 실험 번호를 조정합니다.

모든 실험 매개변수를 설정하고, 이전에 아가로스 데이터셋을 비슷한 방식으로 적합시켜 얻은 빈 풀 값을 입력합니다. 응축된 빈 코드의 첫 번째 부분을 실행하여 물 종단 완화에 대한 적합도를 얻습니다. 그 다음 응축 빈 피팅 섹션을 실행하여 피팅 함수의 최소화를 보여주는 실시간 도표를 시작합니다.

다음 코드 섹션을 실행하여 불확실성을 파악하고 데이터를 그래프로 표시하세요. REDIFINE 적합은 희석상 및 응축상 확산 계수, 응축상 단백질 집단, 평균 방울 크기 및 FUS N-말단 도메인 샘플의 간기 투과성을 결정했습니다. FUS N-말단 도메인의 NMR 신호는 응축상 상태에서도 검출 가능했습니다.

페이식 샘플을 기준으로 한 아가로스 기준과 FUS N-말단 도메인 간에 자화 전달 프로파일에 차이가 관찰되지 않았습니다. CAG 반복 RNA 응축체에서는 NMR 신호가 관찰되지 않습니다. 따라서 자화화 전달 프로파일은 아가로스 기준과 상당히 다릅니다.

CONDENSE-MT 실험은 반복 확장에 따른 RNA 응축체의 동적 특성화를 제공했습니다. CONDENSE-MT 분석을 통해 응축수와 벌크수 간의 양성자 교환 속도론이 밝혀졌습니다. CONDENSE-MT 분석은 응축수 내 RNA의 횡방향 이완 시간과 벌크워터의 겉보기 횡방향 이완 속도도 제공하였습니다.

이 프로토콜에서는 화학 태그 없이 이상 상태에서 응축액의 특성을 특성화할 수 있습니다. 방울은 희석된 환경과 공존하여 세포 환경을 모방하는 두 상 간 교환을 가능하게 합니다. 응축수 특성화에 중점을 둔 우리의 방법은 기존 NMR 기법과 함께 분자 구조 상호작용과 상에 걸친 동역학을 연구할 수 있습니다.

향후 연구에서는 더 복잡한 응축수 모델을 개발하고, 이 방법론을 더 복잡한 시스템에 적용하며, 궁극적으로는 응축수를 세포 내 환경에서 직접 연구할 계획입니다.