24웰 랙을 이용한 중간 처리량 컬럼 DNA 추출

본 연구는 수동 방식과 자동화 방식의 가교 역할을 하는, 병렬 스핀 컬럼 DNA 및 RNA 추출용 3D 프린팅 랙에 초점을 맞추고 있습니다. 이 장치는 최대 116개의 DNA 또는 RNA 샘플을 동시에 처리할 수 있게 함으로써, 노동 집약적인 수동 스핀 컬럼 방식의 한계점을 해결합니다. 먼저, 0.4 millimeter 노즐이 장착된 FDM(fused filament) 3D 프린터를 사용하여 랙을 출력하십시오.

100% 채우기(infill) 설정의 일반 폴리락타이드(PLA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 글리콜(PETG) 또는 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS) 필라멘트를 사용하십시오. 레이어 높이를 0.1 millimeter로 설정하고 표면 다듬기(surface smoothing) 기능을 활성화하십시오. 수밀성과 기계적 안정성이 확보되도록 출력 설정을 조정하십시오.

랙을 처음 사용하기 전에 방수 상태를 테스트하십시오. 사용 전 테스트를 위해 프린트된 저장조에 70% ethanol을 채웁니다. 원심분리를 점진적으로 시간을 늘려가며 수행하여 누수나 구조적 손상이 없는지 확인하십시오.

접착제를 이용한 테스트를 성공적으로 마친 후, 베이스 저장조 구성 요소들을 결합하여 밀폐된 유닛을 형성합니다. 적절한 항생제가 포함된 3~5 mL의 lysogeny broth 또는 LB 배지에 escherichia coli 또는 E.Coli 형질전환체를 접종합니다. 배양액을 37 °C에서 12~16시간 동안 흔들어 배양합니다.

2000 G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 회수합니다. 상층액을 제거합니다. 펠렛에 250 microliters의 재현탁 버퍼를 추가합니다.

그리고 볼텍싱이나 피펫팅을 통해 펠렛을 완전히 재현탁합니다. 용해 버퍼 250 µL를 첨가합니다. 그런 다음 튜브를 4~6회 반전시키거나 24-웰 플레이트를 흔들어 부드럽게 혼합합니다.

중화 버퍼 350 µL를 첨가하고 혼합합니다. 흰색 침전물이 형성되는 것을 관찰하여 중화가 성공적으로 이루어졌는지 확인합니다. 이산화티타늄 분말이 들어 있는 튜브에 용해 버퍼를 첨가합니다.

부피 대 질량 비율을 2:1로 첨가합니다. 이산화티타늄 현탁액 250 µL를 용해물에 추가합니다. 그리고 튜브를 흔들어 혼합합니다.

중화 버퍼 350 µL를 첨가하고 충분히 혼합한다. 2000 G에서 10분 동안 원심분리한다. 이산화티타늄의 존재 하에 세포 펠렛이 완전히 침전되고 상층액이 완전히 투명해진 것을 관찰한다.

이산화티타늄이 없는 경우, 상층액에 잔류 침전물이 존재하는지 확인하십시오. 침전물을 건드리지 않고 상층액을 수집하여 결합 컬럼으로 옮깁니다. DNA 결합 컬럼을 랙의 컬럼 홀더 층에 배치하십시오.

원심분리 중 컬럼 덮개가 고정될 수 있도록 지정된 슬롯에 배치합니다. 정제 또는 필터 컬럼을 결합 컬럼 바로 위의 필터 컬럼 층에 배치합니다. 준비된 중화 용해물을 여과 컬럼으로 옮깁니다.

조립된 랙을 스윙 버킷 플레이트 로터에 넣습니다. 실온에서 2000 G로 1분 동안 원심분리합니다. 원심분리기로부터 랙을 꺼낸 후, 필터 컬럼 층을 제거하여 폐기합니다.

저장조에서 흘러나온 여액을 폐기물 용기에 버립니다. 결합 컬럼을 사용하여 랙을 다시 조립합니다. 각 결합 컬럼에 500 내지 700 µL의 세척 버퍼를 추가합니다.

2000 G에서 1분 동안 원심분리합니다. 리저버의 통과액을 버리고, 앞서 시연한 바와 같이 세척 단계를 반복합니다. 랙에서 결합 컬럼을 꺼내 2 mL 수집 튜브로 옮깁니다.

멤브레인을 건조시키기 위해 10,000 G 이상의 속도로 1분 동안 원심분리합니다. 컬럼을 깨끗한 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 멤브레인에 50 microliters의 용출 버퍼 또는 물을 직접 가하고 실온에서 1분 동안 배양합니다.

DNA를 용출시키기 위해 10,000 G 이상의 속도로 1분 동안 원심분리합니다. 총 플라스미드 수율은 기존 방법과 랙 구성(rack configurations)을 이용한 추출 방법 사이에 유의미한 차이가 없었습니다. 플라스미드 확인 결과, 이완형(relaxed), 선형(linearized) 및 초나선형(super coiled) 형태가 유사한 분포를 보여 보존된 것으로 나타났습니다.

염료 분포는 충진된 컬럼 바로 아래의 폐기물 영역으로 제한되었으며, 인접한 웰이나 주변 컬럼 팁에서는 가시적인 신호가 검출되지 않았습니다. 이는 랙 설계가 튀김 현상과 컬럼 간 교차 오염의 가능성을 낮춘다는 것을 나타냅니다. 증폭은 앰플리콘이 첨가된 컬럼의 용출액에서만 검출되었습니다. 이 입자를 통해 연구자는 클로닝, 시퀀싱 및 PCR 분석을 포함한 하위 응용 분야를 위해 고품질의 플라스미드 DNA를 얻을 수 있습니다.

본 프로토콜을 수행할 때 가장 중요한 고려 사항은 수밀성이 유지되고 넘침이 없는 3D 프린팅 리저버를 유지하여 교차 오염을 방지하는 것입니다. 또한, 이 절차를 거친 랙은 모든 컬럼 기반 핵산 추출 분석에 사용할 수 있습니다.