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	<li>Roth, T. L., Puig-Saus, C., Yu, R., Shifrut, E., Carnevale, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+T+cell+function+and+specificity+with+non-viral+genome+targeting.">Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.</a> Nat Biotechnol. 36 (4), 285-297 (2018).</li><li>Li, L. H., McCarthy, P., Hui, S. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+electrotransfection+of+human+primary+hematopoietic+stem+cells.">High-efficiency electrotransfection of human primary hematopoietic stem cells.</a> FASEB J. 15 (1), 159-167 (2001).</li><li>Parnas, O., Jovanovic, M., Eisenhaure, T. M., Herbst, R. H., Dixit, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+CRISPR+screen+in+primary+immune+cells+to+dissect+regulatory+networks.">A genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks.</a> Cell. 162 (3), 675-686 (2015).</li><li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery.">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).</li><li>Pollack, M. G., Fair, R. B., Shenderov, A. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrowetting-based+actuation+of+liquid+droplets+for+microfluidic+applications.">Electrowetting-based actuation of liquid droplets for microfluidic applications.</a> Appl Phys Lett. 77 (11), 1725-1726 (2000).</li><li>Sinha, H., Quach, A. B. V., Vo, P. Q. N., Shih, S. C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microfluidic+gene-editing+platform+for+deciphering+cancer+genes.">An automated microfluidic gene-editing platform for deciphering cancer genes.</a> Lab Chip. 18 (21), 3291-3301 (2018).</li><li>Little, S. R., Rizzetto, S., Sherwood, C. A., Quach, A. B. V., Shih, S. C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tri-droplet+liquid+structure+for+highly+efficient+intracellular+delivery+in+primary+mammalian+cells+using+digital+microfluidics.">A tri-droplet liquid structure for highly efficient intracellular delivery in primary mammalian cells using digital microfluidics.</a> Adv Mater Technol. 8 (11), 2300719 (2023).</li><li>Little, S. R., Vo, P. Q. N., Sinha, H., Shih, S. C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+microfluidic+platform+for+the+microscale+production+of+functional+immune+cell+therapies.">A digital microfluidic platform for the microscale production of functional immune cell therapies.</a> Anal Chem. 97 (21), 11026-11034 (2025).</li><li>Patel, M. A., Boribong, B. P., Sinha, H., Xiao, B., Xie, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+scalable+arrayed+CRISPR+screening+in+primary+cells+enables+discovery+at+the+single+donor+resolution.">Miniaturized scalable arrayed CRISPR screening in primary cells enables discovery at the single donor resolution.</a> Sci Rep. 15, 29350 (2025).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Nguyen, D. N., Roth, T. L., Li, P. J., Chen, P. A., Apathy, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-stabilized+Cas9+nanoparticles+and+modified+repair+templates+increase+genome+editing+efficiency.">Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.</a> Nat Biotechnol. 38 (1), 44-49 (2020).</li></ol>

```html
<table><tbody><tr><td>12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette</td><td>Integra</td><td>4732</td><td>기기</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td></td><td>유동 버퍼</td></tr><tr><td>96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface</td><td>Thermo Fisher</td><td>174927</td><td>구형 세포 프로토콜</td></tr><tr><td>96-well conical-bottom plate</td><td>Sarstedt</td><td>82.1583.001</td><td>구형 세포 프로토콜</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>357421</td><td>1 in 200, Clone A161A1</td></tr><tr><td>Attune Flow Cytometer</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>기기</td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>10564011</td><td>Spheroid culture용 미디어 보충제</td></tr><tr><td>DMF compatible buffer</td><td>DropGenie</td><td></td><td>세포 형질전환</td></tr><tr><td>DropGenie Transfection System</td><td>DropGenie</td><td></td><td>기기</td></tr><tr><td>Echo Acoustic Dispenser 650 Series</td><td>Beckman Coulter Life Scienes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo Qualified 384-well Low Dead Volume</td><td>Beckman Coulter Life Scienes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>유동 버퍼</td></tr><tr><td>EGFP mRNA</td><td>Trilink</td><td>L-7201</td><td></td></tr><tr><td>EVOS Fluorescent Microscope</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>기기</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Spheroid culture용 미디어 보충제</td></tr><tr><td>Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector</td><td>Fida Biosystems ApS</td><td></td><td>기기</td></tr><tr><td>Ghost Dye Violet 510</td><td>Cytek Biosciences</td><td>13-0870</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Cells</td><td>ATCC</td><td></td><td>구형 세포 프로토콜</td></tr><tr><td>Human IL-2 Recombinant Protein,</td><td>Peprotech</td><td>200-02 50ug</td><td>T cell media supplement</td></tr><tr><td>Human Primary Pan CD3+ T Cells</td><td>All Cells</td><td></td><td>냉동보존된 말초 혈액, 부정적 선택된 pan CD3+ 보조 T 세포</td></tr><tr><td>Immunocult CD3/CD28 Activator</td><td>StemCell Technologies</td><td>10970</td><td>T 세포 활성화 미디어</td></tr><tr><td>Immunocult Expansion Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>10981</td><td>T 세포 활성화 미디어</td></tr><tr><td>Incucyte Live Cell Analysis System</td><td>Sartorius</td><td></td><td>기기</td></tr><tr><td>INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot</td><td>Integra</td><td>4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),</td><td>기기</td></tr><tr><td>non targeting synthetic guide RNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3’</td></tr><tr><td>NucleoCounter NC-202</td><td>Chemometec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody</td><td>Biolegend</td><td>380805</td><td>1 in 200, Clone QA20B12</td></tr><tr><td>PE-Cy 7 Anti-Human CD8</td><td>BD Pharmingen</td><td>557750</td><td>1 in 200, Clone RPA-T8</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Spheroid culture용 미디어 보충제</td></tr><tr><td>Poly-L-glutamic Acid (PGA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4761-100MG</td><td>100mg/ml의 농도로 사용</td></tr><tr><td>Prism version 8.0.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease</td><td>IDT</td><td>10017687</td><td></td></tr><tr><td>Spheroid Microplate</td><td>Corning</td><td>3830</td><td>구형 세포 프로토콜</td></tr><tr><td>Surfactant F</td><td>DropGenie</td><td></td><td>세포 형질전환 - DMF 호환 버퍼에 1:20으로 사용하여 완전한 형질전환 버퍼를 만듭니다</td></tr><tr><td>TRAC synthetic guide RNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3’</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25-300-062</td><td>구형 세포 프로토콜</td></tr></tbody></table>
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현탁 t 세포 및 3d 세포 모델에서 저입력 crispr 유전체 편집 및 mrna 트랜스펙션을 위한 디지털 마이크로유체 전기천공 플랫폼

A Digital Microfluidic Electroporation Platform for Low-Input CRISPR Genome Editing and mRNA Transfection In Suspension T Cells and 3D Cell Models

현탁 T 세포 및 3D 세포 모델에서 저입력 CRISPR 유전체 편집 및 mRNA 트랜스펙션을 위한 디지털 마이크로유체 전기천공 플랫폼

Digital microfluidic (DMF) electroporation enables precise, low-volume genetic manipulation of mammalian cells while minimizing cellular input by up to ...

Our research develops automated digital microfluidic platforms for efficient low input transfection and CRISPR gene editing. Standard electrocuration requires millions of cells. This platform achieves efficient editing with only 10, 000 cells per condition.To begin, obtain a T75 flask from the incubator containing CD3 positive human primary T cells. In the tissue culture hood, transfer the cells to a 15 milliliter falcon tube and centrifuge at a relative centrifugal force of 200 for five minutes. Discard the supernatant and re-suspend the pellet in five milliliters of fresh medium.Pipette 10 microliters of cell suspension into a counter cell counting chamber. Using an automated cell counter, determine the cell concentration and viability. Pipette 100, 000 cells into four to five wells of a V-bottom well plate and place on ice.Reconstitute one lyophilized track knockout targeting single guide RNA or other sgRNA and one lyophilized non-targeting control, or NTC sgRNA, in nucleus free water to a stock concentration of 100 micromolar. After preparing a 100 milligram per milliliter stock solution of polyL-glutamic acid, or PGA, in nucleus free water in two tubes, label the tubes as, tra

a-digital-microfluidic-electroporation-platform-for-low-input-crispr

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 인간 T 세포에서 유전자 편집을 수행하는 방법을 보여줍니다. 1차 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물은 CRISPR-Cas9 리보핵단백질 복합체와 결합되어 knockout을 위한 특정 유전자를 표적으로 합니다. 전기천공법(electroporation) 시 sgRNA는 Cas9을 타겟 DNA 염기서열로 유도하여 정밀한 절단을 생성합니다. 그런 다음 이러한 절단은 세포의 비상동 말단 결합 메커니즘에 의해 복구되어 유전자 녹아웃으로 이어집니다.

T 세포의 유전자 편집을 위한 CRISPR-Cas9 기술

우리는 마이크로 스케일 세포 자극 실험에 자동 세포 배양 및 심문 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 양성 세포의 작은 인구를 자극 분자 분석을위한 해물을 복구하는 간단한 다목적 및 정밀한 컨트롤을 제공합니다. 플랫폼은 물론 귀중한 세포 및 / 또는 시약을 사용하는 연구에 적합합니다.

마이크로 스케일 세포 자극 실험을위한 다목적 자동화 플랫폼

미세 유체 와류를 이용한 일렉트로 플랫폼은 정확하고 독립적 인 투여 량 제어와 동일한 세포 집단에 여러 분자의 순차적 전달을 위해 개발되었다. 시스템의 크기에 기초하여 목표 셀 정제 단계 이전 일렉트로 분자 전달 효율 및 처리 된 세포의 생존 능력을 향상시키는 데 도움.

마이크로 소용돌이를 이용한 순차 분자 전달을위한 Electroporator을

차세대 전기천공법은 유전자 발현과 세포 거동을 변경하기 위해 인간 Th17 세포를 작은 RNA로 형질 주입하는 효율적인 방법입니다.

차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

여기에 제시된 것은 튜브 전기포공을 이용한 포유류 세포에서 효율적인 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질 매개 유전자 편집을 위한 프로토콜이다.

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

이 프로토콜은 형광 기자 및 세포 분류를 사용하여 대식세포 및 T 세포주에서 노크-인 실험을 단순화합니다. 2개의 플라스미드는 면역 세포에 있는 Rosa26 메뚜기에서 영구적으로 통합되는 EBFP2를 표현하는 EBFP2를 표현하는 상동성 재조합 기증자 플라스미드와 CRISPR/Cas9- 및 DsRed2 표현 플라스미드와 균등하게 재조합 기증자 플라스미드인 이러한 단순화된 노크-인 실험에 사용됩니다.

CRISPR/Cas9 및 대식세포 및 T 세포주에서 세포 분류에 의한 유전자 노크인

이 프로토콜은 랩온어칩, 마이크로유체 전기천공 장치를 구축하는 데 필요한 미세 가공 기술을 설명합니다. 실험 설정은 연속 흐름에서 제어된 단일 세포 수준 형질주입을 수행하며 집단 기반 제어를 통해 더 높은 처리량으로 확장할 수 있습니다. 세포막 투과 정도를 실시간으로 전기적으로 모니터링하는 기능을 보여주는 분석이 제공됩니다.

연속 흐름의 제조 및 작동, 투과화 감지 기능이 있는 미세 전기 천공 시스템

이 프로토콜은 플라스미드 DNA 형질주입 및 mRNA 핵 박션을 사용하여 인간 세포주에서 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기반 후성유전체 편집 방법을 설명합니다.

Plasmid DNA Transfection 및 mRNA Nucleofection Delivery를 사용한 인간 세포의 CRISPR 에피게놈 편집

이 프로토콜은 전기 천공 프로토콜의 고처리량 분석을 위해 3차원 조직 모방 내에서 형질감염된 세포의 공간적 분포를 사용하여 계산 모델링을 사용하여 가역적 및 비가역적 전기천공 임계값을 정량화합니다.

전기천공 임계값의 정량화를 위한 고처리량 가능 3차원 조직 모델

RNA로서 게놈 편집자를 전달하는 것은 1차 포유류 세포와 세포주의 게놈을 변형하는 데 특히 강력한 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 유전체 편집기를 mRNA로 1차 포유류 세포와 세포주에 전달한 후, 표적 Illumina 시퀀싱과 분석을 통해 편집 결과를 정량화하는 것입니다.

1차 포유류 세포에서 편집자 RNA의 전기천공을 통한 유전체 편집

DropGenie.  이 프로토콜은 디지털 마이크로유체 전공 플랫폼인 'DMF-ection'을 사용하여 원차 인간 T 세포에서 TCRα/β 수용체의 소형화된 CRISPR–Cas9 유전체 편집을 설명합니다. 이 방법은 병렬, 저입력 유전자 편집을 높은 생존율로 가능하게 하며, 다세포 3D 구형체에 mRNA 전달에도 추가적으로 적응할 수 있습니다.

현탁 T 세포 및 3D 세포 모델에서 저입력 CRISPR 유전체 편집 및 mRNA 트랜스펙션을 위한 디지털 마이크로유체 전기천공 플랫폼

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