지방 기질 혈관 분율에서 반사광을 이용한 노화 검출

우리는 비만과 고인슐린혈증 같은 다양한 지방 데포 및 대사 상태에서 지방세포 노화를 연구합니다. 전통적인 브라이트필드 기반 SABG 분석법은 다중화를 허용하지 않고 매우 주관적입니다. 우리의 새로운 프로토콜은 덜 주관적이며 다중화를 허용합니다.

우선, 인간 지방 조직이 담긴 관을 꺼내세요. 지방 조직 10g을 균질화하여 0.05% 1형 콜라원 효소가 들어있는 튜브에 넣어 약 100만 개의 기질 혈관 분획(SVF) 세포를 얻습니다. 각 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 50만 개의 세포를 알리코트로 넣어.

세포 고정을 위해 튜브에 2% 파라포름알데히드 1밀리리터를 추가하세요. 그 후 실온에서 흔들기 위에서 20분간 배양하세요. 600G에서 10분간 원심분리하고 상원액을 제거하세요.

제조사 지침에 따라 노화 베타-갈락토시다제 염색 키트를 사용해 X-Gal 염색 용액을 준비하세요. 염색 용액 1밀리리터를 세 개의 신선한 튜브에 넣으세요. 그리고 1몰 염산 또는 1몰 수산화나트륨 용액을 사용해 pH를 5, 6, 8으로 조절하세요.

보정된 pH 미터를 사용해 pH를 확인하세요. pH 조절된 X-Gal 염색 용액을 50만 개의 셀이 포함된 각 라벨링 튜브에 첨가합니다. 이산화탄소 없이 37도에서 24시간 배양하세요.

세포를 600G에서 10분간 원심분리하세요. 상정액을 제거한 후 세포를 PBS로 세척하세요. 그리고 다시 600G에서 10분간 원심분리합니다.

상원액을 제거한 후, 이질적인 SVF 내 내피세포를 식별하기 위해 내피세포 특이적 CD31로 세포를 배양하거나 IgG 1차 항체를 4도 섭씨에서 밤새 배양합니다. 세포를 0.1% PBST로 세 번 세척하여 상온에서 10분간 로커 위에 올려 제거하세요. 그리고 600G에서 10분간 원심분리기로 돌려주세요.

상정액을 버린 후, 상온에서 로커 위에서 2차 항체와 함께 1시간 배양합니다. 600G에서 10분간 원심분리하여 2차 항체 염색액을 제거하세요. 앞서 보인 것처럼 PBST로 셀을 세 번 세척한 후 원심분리기를 사용하세요.

안티페이드 마운트에 세포를 다시 현탁하세요. 세포 현탁액을 현미경 슬라이드에 피펫 붙이고 실온에서 하룻밤 경화시켜 세포를 고정시키세요. 다음 날에는 100% 글리세롤 100마이크로리터를 추가하세요.

커버 슬립을 위에 올려놓고 매니큐어로 밀봉하세요. 준비된 슬라이드를 공초점 현미경 스테이지 위에 올려놓습니다. 현미경 소프트웨어 인터페이스에서 광 경로 옵션을 선택하고 빔 스플리터 설정을 T90R10으로 조정하세요.

다음으로, 미러 설정에서 2차 이색성 미러(SDM)의 컷오프 파장 값을 검증합니다. 검출기 메뉴에서 염료 및 검출기 선택 옵션을 클릭하여 채널과 여기 파장을 할당하세요. 그 다음 각 레이저별로 레이저 출력 강도 백분율 값을 10%에서 15% 범위로 설정하세요. 시리즈 메뉴의 LSM 섹션에서 Z 옵션을 켜기로 전환하세요. Z 단계 크기를 시스템 최적 0.74마이크로미터로 설정하세요.

다음, Z 섹션 메뉴에서 시작 입력 필드 값을 입력하고 멤브레인 신호를 기반으로 Z 스택을 정의하여 전체 세포 부피를 포착합니다. 획득 패널에서 LSM 입력 필드에 파일 이름과 저장 위치를 입력하세요. 그리고 LSM Start를 클릭해 이미지 획득을 시작하세요.

그리고 파일을 원본 현미경 형식으로 저장하세요. 획득 후에는 Z 내비게이션 화살표를 사용하여 전체 Z 스택에 걸친 다양한 염료의 신호와 초점 분포를 검증합니다. 저장된 원본 파일을 Image에 업로드하고 Bio-Formats Import Options 팝업 창 J.In '확인'을 클릭하세요.

이미지 메뉴를 클릭하여 파일을 열어보세요. 드롭다운 옵션에서 색상을 선택한 후 채널 분할 옵션을 선택하면 채널별로 별도의 창으로 열리세요. 다음으로, 이미지 메뉴의 Adjust 옵션을 사용해 밝기 대비를 조정하고 LUT 값을 최적화하여 이미지를 더욱 잘 시각화하세요.

프레임 하단의 Z축 스크롤 바를 사용해 광학 섹션을 탐색하고 스택 전체의 셀룰러 특징을 검증하세요. 이미지 메뉴에서 스택을 선택하세요. 그 후 Z 프로젝트 함수를 선택하여 3차원 공초점 이미지의 합 강도 투영을 생성합니다.

Z 투영 대화 상자에서 시작과 종료 슬라이스 범위를 정의하세요. 투영 유형을 선택하고 'OKAY'를 클릭하면 최종 2D 합성 이미지를 얻을 수 있습니다. 다음으로 이미지 메뉴로 이동하세요.

이미지 유형을 16비트로 조정하려면 타입 옵션을 선택하세요. 그 후 이미지를 16비트 TIF 파일로 저장하고 내보내세요. 저장된 이미지를 CellProfiler 버전 4.2.8로 가져오면 자동 셀 분할, 각 셀의 반사광 세기 정량화, 그리고 세기 측정값을 스프레드시트로 내보내는 작업이 가능합니다.

스프레드시트에서 노화 관련 베타-갈락토시다아제 양성의 임계값을 pH 8 조건의 평균 반사광 강도에 3표준편차를 더한 합으로 정의합니다. pH 6 상태의 세포는 강도 값이 설정된 임계값을 초과하면 노화 관련 베타-갈락토시다제 양성으로 분류합니다. 반사광 노화 관련 베타-갈락토시다제 염색은 세 가지 pH 수준에서 명확하고 재현 가능한 패턴을 생성했습니다.

pH 5에서는 대부분의 세포가 높은 내인성 효소 활성으로 강한 신호를 보였습니다. pH 6의 검사 표준 값에서는 신호 강도와 빈도가 감소하여 노화 관련 베타-갈락토시다아제 세포를 구체적으로 식별할 수 있게 되었습니다. pH 8에서는 신호가 최소였고, 이것이 양성 임계치를 정의하는 기준선이 되었습니다.

검출 감도 시험 결과, 반사광 영상이 모든 pH 조건에서 브라이트필드보다 우수한 성능을 보였습니다. pH 5에서 반사광은 강한 X-Gal 침전물을 보였으나, Brightfield는 가장 큰 퇴적물만 포착했습니다. pH 6에서 반사광은 밝은 영역에서 너무 약하거나 확산된 양성 세포를 식별했습니다.

pH 8에서 반사광 영상은 낮은 효소 활성과 일치하는 최소한의 신호를 감지하여 중간 및 낮은 활성 수준에서 X-Gal 침전물을 식별하는 데 있어 Brightfield보다 우수한 성능을 보였습니다. 이 반사광 영상 워크플로우는 pH 의존적 노화 관련 베타-갈락토시다제와 CD31과 같은 형광 기반 마커의 동시에 검출을 통합하여, 이질적인 SVF 집단 내에서 단일 세포 해상도로 다기능 노화 평가를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 민감하고 정량적인 SABG 활성 측정을 가능하게 하며, 동시에 다른 노화 지표뿐만 아니라 다른 세포 표지자도 측정할 수 있게 합니다.

가장 큰 도전은 초기 현미경 설치라고 생각합니다. 하지만 최적화가 완료되면 실험마다 동일한 획득 매개변수를 사용할 수 있습니다. 향후 연구에서는 이 분석법을 다른 세포 내 지표와 결합하여 SABG가 다양한 세포 과정과 어떻게 연관되는지 확인할 수 있습니다.