백발유 초기 배아 발생에서 신생 전사체의 대사 표지

본 연구에서는 초기 조수 배아 발생 과정에서 접합 유전자 활성화와 전이 조절이 어떻게 일어나는지 조사합니다. 기존 방법들은 새로 활성화된 접합 전사체가 풍부한 모체 RNA를 방출하는 것을 검출하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 이 프로토콜은 초기 전사체를 표지하고 풍부하게 합니다.

먼저, 미세 주입 챔버를 입체 현미경 아래에 두고 1밀리리터의 피콜 용액을 챔버에 넣으세요. 0.1배에 저장된 Xenopus laevis 배아를 얻으세요. 수정된 링거 또는 MMR 용액을 표시하세요. 플라스틱 이식 피펫을 사용해 20개 이상의 배아를 미세주입 챔버 중앙으로 옮깁니다.

유리 바늘의 가는 끝을 핀셋으로 자르며 주사 바늘을 준비하세요. 바늘을 수직으로 위치시키고 팁을 아래로 향하게 한 후, 마이크로로더 팁이 장착된 P2 피펫을 사용해 50 mM 5-에티닐루딘 또는 5 M EU 0.5 마이크로리터를 적재합니다. 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 장착하세요.

P10 피펫을 사용해 스테레오 현미경 아래에 위치한 스테이지 마이크로미터에 10마이크로리터의 할로카탄 오일을 배치합니다. 부피 보정을 위해 마이크로 인젝터 발 페달을 눌러 마이크로미터의 할로카본 오일에 방울을 주입하세요. 마이크로 인젝터의 압력과 주입 시간을 드롭 직경이 0.27밀리미터가 될 때까지 조절하세요.

핀셋으로 1세포 단계 배아를 잡고 마이크로 매니퓰레이터로 바늘을 조절해 50 mM 5 EU 10나노리터를 주입하세요. 주입된 배아를 Ficoll 용액이 들어있는 새 유리 접시에 옮기고 1시간 동안 배양합니다. Ficoll 용액을 제거하고 0.1 XMMR 용액을 추가하세요. 발달 중 배아를 육안으로 검사하고 필요시 이상 배아를 제거하세요.

원하는 발달 단계의 배아 10개를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 이식합니다. 튜브에서 남은 배지를 제거하고, 배아를 액체 질소에 급동한 후 영하 80도 냉동고에 보관하세요. 그 후 배아에서 총 RNA를 추출하고, 상업용 키트를 사용해 농도를 측정합니다.

50마이크로리터 클릭 반응을 만들려면, 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에서 표시된 성분들을 혼합합니다. 반응 혼합물을 상온의 뉴테이터 위에서 30분간 배양하세요. 이제 각 반응 혼합물에 글리코겐, 아세트산 암모늄, 냉각된 에탄올을 추가하세요.

피펫팅으로 다섯 번 잘 섞으세요. 영하 80도 냉동고에서 하룻밤 배큐하세요. 하룻밤 배양 후, 13,000g 원심분리기를 4도 섭씨에서 20분간 가열한 후, 펠릿을 흐트러뜨리지 않고 상청액을 제거한다.

75% 에탄올 700마이크로리터로 펠릿을 두 번 세척하세요. 원심분리 후 상원액을 버린 후, 펠릿을 실온에서 5분에서 10분간 자연 건조한 후 RNase 무첨가물 10마이크로리터에 재현탁합니다. 스트렙타비딘 코팅된 자기 구슬 5마이크로리터를 새로운 1.5밀리리터 튜브에 투여합니다.

비즈에 워시 버퍼 2 9마이크로리터를 넣고 잘 섞으세요. 튜브를 자석 선반에 2분간 올려놓습니다. 상원액을 제거하고 세척을 두 번 더 반복하세요.

그 다음 5마이크로리터의 워시 버퍼 2에 비즈를 다시 부유합니다. 1.5 마이크로리터 마이크로 원심분리기 튜브에 마스터 믹스를 준비하세요. RNA 샘플이 담긴 각 튜브에 마스터 믹스 15마이크로리터를 추가합니다.

튜브를 열블록 위에 올려놓고 69도 섭씨에서 5분간 배양합니다. 그 후에는 튜브를 얼음 위에 올려놓으세요. 그 다음 각 RNA 샘플에 미리 세척된 구슬 5마이크로리터를 추가하고, 상온의 뉴테이터 위에서 30분간 배양합니다.

비드 RNA 복합체를 50마이크로리터 워시 버퍼 1로 다섯 번 세척한 후, 50마이크로리터 워시 버퍼 2로 다섯 번 세척합니다. 비즈를 5마이크로리터 세척 버퍼 2에 다시 떠올립니다. 신생 EU RNA를 포함한 구슬을 직접 사용하여 상보적 디옥시리보핵산 합성과 라이브러리 준비를 수행합니다.

수정 후 6시간 시점의 신생 전사체와 수정 5시간 후의 접합 유전체 활성화 과정에서 차이 활성화된 유전자의 수가 증가했고, 수정 7시간, 수정 8시간, 수정 9시간 후에도 추가 증가가 관찰되었다. 접합 유전자는 전체 RNA 시퀀싱 데이터와 비교해 초기 EU RNA 시퀀싱 데이터에서 더 높은 수준과 초기 시점에서 검출되었습니다. 대사적으로 표지된 신생 RNA의 신중한 정제가 이 프로토콜에서 민감도와 특이성을 보장하는 데 가장 중요한 요소입니다.

이 프로토콜로 생성된 EU 표지된 신생 RNA는 시험관 내에서 생화학적으로 추가 분석할 수 있습니다. 이 접근법은 향후 유전체 활성화 패턴, 조직 특이적 유전자 발현, 단일 세포 해상도로서의 조절 메커니즘을 조사할 수 있는 연구를 가능하게 합니다.