테르트-부틸 하이드로퍼옥사이드를 이용한 스트레스 유발 조기 노화 유도 프로토콜

본 연구는 멜라닌 세포의 노화 표현형과 그것이 외인성 피부 노화에 기여하는 영향을 조사하는 데 중점을 둡니다. 기존의 노화 모델은 섬유아세포를 사용하므로 멜라닌 세포 특유의 생물학적 특성을 포착하지 못합니다. 본 프로토콜은 일차 배양된 인간 멜라닌 세포에 tBHP 매개 산화 스트레스를 유도합니다.

먼저, 필요한 시약을 준비합니다. 멜라닌 세포를 해동하고 3일 동안 회복시킨 후, 세포 파종 당일에 세포 밀도가 80~90% confluency에 도달했는지 확인하십시오. 플라스크에서 배지를 흡입하여 제거합니다.

DPBS로 세포를 두 번 세척합니다. 세포를 분리하기 위해 trypsin EDTA 용액 2 mL를 첨가합니다. 플라스크를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에 5분 동안 둡니다.

플라스크를 가볍게 두드립니다. 현미경으로 세포를 관찰하여 완전히 분리되었는지 확인합니다. 반응을 중단시키기 위해 트립신 억제제(trypsin inhibitor)를 부피의 1.5배만큼 첨가합니다.

세포 현탁액을 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. DPBS를 사용하여 현탁액을 최종 부피 10밀리리터가 되도록 희석합니다. 세포 현탁액을 100의 상대 원심력으로 5분 동안 원심 분리합니다.

상층액을 흡입하여 제거하고, 세포 펠렛을 원하는 부피의 배지에 다시 현탁합니다. tert-Butyl hydroperoxide(tBHP) 처리 플레이트의 경우 10 centimeter 디쉬당 600, 000개의 세포를 분주합니다. 대조군 플레이트의 경우 플레이트당 400, 000개의 세포를 분주합니다.

DPBS 또는 배지를 사용하여 tBHP 스톡으로 10 millimolar 작업 용액을 준비합니다. 처리당 100 micromolar tBHP를 세포에 첨가하고 1시간 동안 처리합니다. 플레이트를 앞뒤로 움직여 tBHP가 배지 전체에 고르게 분산되도록 합니다.

세포를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 인큐베이터에 정확히 1시간 동안 배양합니다. tBHP 처리를 종료하기 위해 배지를 흡입하여 제거합니다. 37 °C로 예열된 DPBS로 플레이트를 두 번 세척합니다.

플레이트에 적절한 부피의 신선한 배지를 추가합니다. 플레이트를 배양기에 넣고 다음 처리 전까지 세포가 최소 4시간 동안 회복되도록 합니다. 당일 중으로 처리 절차를 반복하여 2차 처리를 수행합니다.

4일까지 처방 요법을 계속한 다음, 노화 마커를 평가하기 위해 9일까지 세포 배양을 유지합니다. tBHP 처리 세포와 대조군 세포의 수를 측정합니다. 초기 밀도와 동일하게 세포를 다시 파종하거나, tBHP 처리 플레이트에서 얻은 세포가 600, 000개 미만인 경우 수집된 모든 세포를 다시 파종합니다.

배양 4일, 9일, 15일에 세포 수를 측정합니다. 9일째에 PBS로 세포를 2회 세척합니다. 2% formaldehyde와 0.4% glutaraldehyde를 사용하여 세포를 고정합니다.

고정된 세포를 PBS로 두 번 세척합니다. 고정된 세포를 pH 6의 염색 용액에서 배양합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 덮은 후, 이산화탄소가 없는 상태에서 37 °C로 18시간 동안 배양합니다.

PBS로 세포를 두 번 세척하십시오. 광학 현미경을 사용하여 청색으로 염색된 세포의 수를 촬영하고 계수하십시오. 이를 동일 시야 내의 총 세포 수로 나눕니다.

결과를 양성 세포의 백분율로 표시하십시오. 산화적 스트레스 유도 후, tBHP 처리는 대조군에 비해 멜라닌 세포의 증식을 유의하게 감소시켰습니다. 처리된 세포는 9일 차까지 누적 세포 분열 횟수인 cPDL이 1.4에 불과했던 반면, 대조군은 3.1 cPDL에 도달했습니다.

15일째에 처리된 세포는 1.9 cPDL에서 정체된 반면, 대조군 세포는 5.1 cPDL까지 증식했습니다. tBHP 처리된 멜라닌세포는 측정된 모든 시점에서 대조군에 비해 세포 표면적이 증가했으며, 이러한 확대는 15일까지 진행되었는데, 이는 노화 세포의 확대 및 평탄화된 형태와 일치합니다. tBHP 처리된 멜라닌세포는 노화 관련 베타-갈락토시다제(SA-beta-galactosidase) 활성의 증가를 보였으며, 대조군의 3%에 비해 32%의 양성 세포가 관찰되었습니다.

SA-beta-galactosidase 양성 반응의 증가는 노화 표현형과 일치하였습니다. 면역형광 분석 결과, 대조군에 비해 tBHP 처리된 멜라닌 세포에서 gamma-H2AX 수치가 증가한 것으로 나타났습니다. 처리된 세포는 대조군보다 더 강한 gamma-H2AX 신호를 보였습니다.

실시간 정량 PCR 분석 결과, 노화 관련 분비 표현형 인자의 발현이 증가했으며, 그 중 interleukin-8의 증가 폭이 가장 컸습니다. 반면 interleukin-6와 matrix metalloproteinase-1은 중간 정도의 증가를 보였습니다. Western blot 분석을 통해 노화 유도를 확인하였습니다.

tBHP 처리된 멜라닌 세포에서는 대조군과 비교하여 Lamin B1이 유의하게 감소했습니다. tBHP 처리된 멜라닌 세포에서는 대조군과 비교하여 인산화된 retinoblastoma 단백질 수준이 감소했습니다. tBHP 처리는 멜라닌 세포에서 p16 및 p21의 전사 발현을 증가시켰습니다.

이 모델을 통해 연구자들은 노화된 멜라닌 세포가 색소 침착에 어떠한 영향을 미치는지, 그리고 SASP 염증 인자를 통해 주변 세포와 어떻게 소통하는지 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜의 핵심 과제는 정확한 타이밍입니다. tBHP는 최소 4시간의 간격을 두고 하루에 두 번 처리해야 합니다.

이 프로토콜에 따라, 노화 관련 베타-갈락토시다아제(senescence-associated beta-galactosidase) 염색, 면역형광법, RT-qPCR 및 확립된 노화 마커의 웨스턴 블롯팅을 이용하여 노화 특성을 규명할 수 있습니다.