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	<li>Hussein, R. S., Bin Dayel, S., Abahussein, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+skin+and+intrinsic+aging:+biological,+environmental,+and+therapeutic+insight.">Influences on skin and intrinsic aging: biological, environmental, and therapeutic insight.</a> J Cosmet Dermatol. 24, e16688 (2025).</li><li>Dorf, N., Maciejczyk, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+senescence-from+basic+research+to+clinical+practice.">Skin senescence-from basic research to clinical practice.</a> Front Med (Lausanne). 11, 1484345 (2024).</li><li>Grenier, A., Morissette, M. C., Rochette, P. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+cigarette+smoke+and+solar+rays+causes+effects+similar+to+skin+aging+in+a+bilayer+skin+model.">The combination of cigarette smoke and solar rays causes effects similar to skin aging in a bilayer skin model.</a> Sci Rep. 13, 17969 (2023).</li><li>Varani, J., Dame, M. K., Rittie, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+collagen+production+in+chronologically+aged+skin:+roles+of+age-dependent+alteration+in+fibroblast+function+and+defective+mechanical+stimulation.">Decreased collagen production in chronologically aged skin: roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation.</a> Am J Pathol. 168, 1861-1868 (2006).</li><li>Zhang, S., Duan, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fighting+against+skin+aging:+the+way+from+bench+to+bedside.">Fighting against skin aging: the way from bench to bedside.</a> Cell Transplant. 27, 729-738 (2018).</li><li>Hussen, N. H. a., Abdulla, S. K., Ali, N. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+antioxidants+in+skin+aging+and+the+molecular+mechanism+of+ROS:+a+comprehensive+review.">Role of antioxidants in skin aging and the molecular mechanism of ROS: a comprehensive review.</a> Aspects Mol Med. 5, 100063 (2025).</li><li>Addor, F. A. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+photoaging:+additional+factors+involved+in+the+process+of+skin+aging.">Beyond photoaging: additional factors involved in the process of skin aging.</a> Clin Cosmet Investig Dermatol. 11, 437-443 (2018).</li><li>Mucha, M., Skrzydlewska, E., GÄ™gotek, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+protection+against+oxidative+stress+in+human+skin+melanocytes.">Natural protection against oxidative stress in human skin melanocytes.</a> Commun Biol. 8, 1283 (2025).</li><li>Hughes, B. K., Bishop, C. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+the+role+of+senescent+melanocytes+in+skin+ageing.">Current understanding of the role of senescent melanocytes in skin ageing.</a> Biomedicines. 10, 3111 (2022).</li><li>Kami&#324;ski, K., Kazimierczak, U., Kolenda, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+in+melanogenesis+and+melanoma+development.">Oxidative stress in melanogenesis and melanoma development.</a> Contemp Oncol (Pozn). 26, 1-7 (2022).</li><li>Jim&#233;nez-Cervantes, C., Mart&#237;nez-Esparza, M., P&#233;rez, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanogenesis+in+response+to+oxidative+stress:+transient+downregulation+of+melanocyte+differentiation+markers+and+possible+involvement+of+microphthalmia+transcription+factor.">Inhibition of melanogenesis in response to oxidative stress: transient downregulation of melanocyte differentiation markers and possible involvement of microphthalmia transcription factor.</a> J Cell Sci. 114, 2335-2344 (2001).</li><li>Da&#324;czak-Pazdrowska, A., Gornowicz-Porowska, J., Pola&#324;ska, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+skin-related+research:+targeted+signaling+pathways+and+naturally+occurring+therapeutic+agents.">Cellular senescence in skin-related research: targeted signaling pathways and naturally occurring therapeutic agents.</a> Aging Cell. 22, e13845 (2023).</li><li>Green, K. J., Pokorny, J., Jarrell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dangerous+liaisons:+loss+of+keratinocyte+control+over+melanocytes+in+melanomagenesis.">Dangerous liaisons: loss of keratinocyte control over melanocytes in melanomagenesis.</a> Bioessays. 46, e2400135 (2024).</li><li>Ali, L., Al Niaimi, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+melasma+explained.">Pathogenesis of melasma explained.</a> Int J Dermatol. 64, 1201-1212 (2025).</li><li>Low, E., Alimohammadiha, G., Smith, L. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+is+the+evidence+that+cellular+senescence+causes+skin+ageing.">How good is the evidence that cellular senescence causes skin ageing.</a> Ageing Res Rev. 71, 101456 (2021).</li><li>Chin, T., Lee, X. E., Ng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cellular+senescence+in+skin+aging+and+age-related+skin+pathologies.">The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies.</a> Front Physiol. 14, 1297637 (2023).</li><li>Gerasymchuk, M., Robinson, G. I., Kovalchuk, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+senescence-associated+phenotype+in+human+skin+fibroblasts.">Modeling of the senescence-associated phenotype in human skin fibroblasts.</a> Int J Mol Sci. 23, 7124 (2022).</li><li>Zimmermann, T., Pommer, M., Kluge, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cellular+senescence+in+human+primary+melanocytes+and+malignant+melanoma+cells+in+vitro.">Detection of cellular senescence in human primary melanocytes and malignant melanoma cells in vitro.</a> Cells. 11, 1489 (2022).</li><li>Tang, J., Li, Q., Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+human+face+skin+melanocytes+for+the+study+of+hyperpigmentation.">Primary culture of human face skin melanocytes for the study of hyperpigmentation.</a> Cytotechnology. 66, 891-898 (2014).</li><li>Ku&#269;era, O., Endlicher, R., Rou&#353;ar, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+tert-butyl+hydroperoxide-induced+oxidative+stress+on+lean+and+steatotic+rat+hepatocytes+in+vitro.">The effect of tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative stress on lean and steatotic rat hepatocytes in vitro.</a> Oxid Med Cell Longev. 2014, 752506 (2014).</li><li>Wedel, S., Martic, I., Hrapovic, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBHP+treatment+as+a+model+for+cellular+senescence+and+pollution-induced+skin+aging.">tBHP treatment as a model for cellular senescence and pollution-induced skin aging.</a> Mech Ageing Dev. 190, 111318 (2020).</li><li>Rabin, D. M., Rabin, R. L., Blenkinsop, T. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+oxidative+stress+upregulates+drusen-related+protein+expression+in+adult+human+RPE+stem+cell-derived+RPE+cells:+a+novel+culture+model+for+dry+AMD.">Chronic oxidative stress upregulates drusen-related protein expression in adult human RPE stem cell-derived RPE cells: a novel culture model for dry AMD.</a> Aging (Albany NY). 5, 51-66 (2013).</li><li>Shakel, Z., Costa Lima, S. A., Reis, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+make+human+skin+models+based+on+cellular+senescence+for+ageing+research.">Strategies to make human skin models based on cellular senescence for ageing research.</a> Ageing Res Rev. 100, 102430 (2024).</li><li>Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanocyte+lineage+in+development+and+disease.">The melanocyte lineage in development and disease.</a> Development. 142, 620-632 (2015).</li><li>Goff, P. S., Castle, J. T., Kohli, J. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transfection+of+melanocytes.">Isolation, culture, and transfection of melanocytes.</a> Curr Protoc. 3, e774 (2023).</li><li>Martic, I., Wedel, S., Jansen-DÃ¼rr, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+to+investigate+UVB-induced+cellular+senescence+and+pigmentation+in+melanocytes.">A new model to investigate UVB-induced cellular senescence and pigmentation in melanocytes.</a> Mech Ageing Dev. 190, 111322 (2020).</li><li>Victorelli, S., Lagnado, A., Halim, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+human+melanocytes+drive+skin+ageing+via+paracrine+telomere+dysfunction.">Senescent human melanocytes drive skin ageing via paracrine telomere dysfunction.</a> EMBO J. 38, e101982 (2019).</li><li>Zhang, H., Davies, K. J. A., Forman, H. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+response+and+Nrf2+signaling+in+aging.">Oxidative stress response and Nrf2 signaling in aging.</a> Free Radic Biol Med. 88, 314-336 (2015).</li><li>Birch, J., Gil, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+the+SASP:+many+therapeutic+avenues.">Senescence and the SASP: many therapeutic avenues.</a> Genes Dev. 34, 1565-1576 (2020).</li><li>Kang, H. Y., Ortonne, J. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+should+be+considered+in+treatment+of+melasma.">What should be considered in treatment of melasma.</a> Ann Dermatol. 22, 373-378 (2010).</li><li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+cell+senescence,+and+novel+molecular+mechanisms+in+aging+and+age-related+diseases.">ROS, cell senescence, and novel molecular mechanisms in aging and age-related diseases.</a> Oxid Med Cell Longev. 2016, 3565127 (2016).</li><li>Almeida, F. V., Douglass, S. M., Fane, M. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bad+company:+microenvironmentally+mediated+resistance+to+targeted+therapy+in+melanoma.">Bad company: microenvironmentally mediated resistance to targeted therapy in melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 32, 237-247 (2019).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin.">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochem Photobiol. 84, 539-549 (2008).</li><li>L&#243;pez-Ot&#237;n, C., Blasco, M. A., Partridge, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+aging.">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153, 1194-1217 (2013).</li><li>Videira, I. F., Moura, D. F., Magina, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+melanogenesis.">Mechanisms regulating melanogenesis.</a> An Bras Dermatol. 88, 76-83 (2013).</li><li>Ratz-&#321;yko, A., Arct, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+as+an+active+ingredient+for+cosmetic+and+dermatological+applications:+a+review.">Resveratrol as an active ingredient for cosmetic and dermatological applications: a review.</a> J Cosmet Laser Ther. 21, 84-90 (2019).</li><li>Xu, M., Pirtskhalava, T., Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senolytics+improve+physical+function+and+increase+lifespan+in+old+age.">Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age.</a> Nat Med. 24, 1246-1256 (2018).</li><li>Ogrodnik, M., Evans, S. A., Fielder, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+senescent+cell+clearance+alleviates+age-related+brain+inflammation+and+cognitive+impairment+in+mice.">Whole-body senescent cell clearance alleviates age-related brain inflammation and cognitive impairment in mice.</a> Aging Cell. 20, e13296 (2021).</li><li>Hernandez-Segura, A., de Jong, T. V., Melov, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+transcriptional+heterogeneity+in+senescent+cells.">Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells.</a> Curr Biol. 27, 2652-2660.e4 (2017).</li></ol>

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<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m membrane filter</td><td>Merck&nbsp;</td><td>SLGVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>1 M citric acid&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>K91567844</td><td>aq. dest.에서 준비</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Merck</td><td>A649033</td><td>aq. dest.에서 준비</td></tr><tr><td>1 M Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>K56036736</td><td>aq. dest.에서 준비</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Lab Honeywell</td><td>30620</td><td>aq. dest.에서 준비</td></tr><tr><td>37% formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>CarlRoth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>5 M Sodium Chloride&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>aq. dest.에서 준비</td></tr><tr><td>50% glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-&beta;-D-Galactopyranosid (X-Gal)</td><td>Sigma</td><td>B9146</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor-conjugated secondary antibody 2 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>BSA (bovine serum albumin)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescent substrate</td><td>Sigma</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Costar CellLifter&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips for cell culture/microscopy</td><td>Epredia</td><td>CB00200RA120MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>DermaLife Basal Medium</td><td>CellSystems</td><td>LM-0004</td><td></td></tr><tr><td>DermaLife M Melanocyte Kit&nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS-1041</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Human neonatal melanocytes</td><td>CellSystems</td><td>FC-0023</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1 antibody (rabbit)</td><td>Abcam</td><td>AB16048</td><td>5% BSA에서 1:1000으로 희석</td></tr><tr><td>Mounting medium containing DAPI</td><td>Abcam</td><td>AB104139</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Polyacrylamide gradient gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine, 0.1 mg/mL&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A38904-01</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferrocyanide</td><td>Sigma</td><td>P-9387</td><td></td></tr><tr><td>pRB antibody (rabbit)</td><td>CellSignalling</td><td>93085</td><td>5% BSA에서 1:1000으로 희석</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>자체 제조</td><td>N/A</td><td>500 mM NaF; 2 &micro;g/ml Aprotinin; 1 mM PMSF; 1 mM activated Na-Orthovanadate</td></tr><tr><td>RIPA buffer&nbsp;</td><td>자체 제조</td><td>N/A</td><td>50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0.5% Na-deoxycholate; 0.1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA 포함</td></tr><tr><td>RLT buffer</td><td>Qiagen</td><td>1015762</td><td>RNeasy Mini Kit에 포함</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk powder (for 5% milk in TBS-T)</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate (for 0.1% solution)</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor, 0.5 mg/mL&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>tert-Butyl hydroperoxide (tBHP)</td><td>Sigma</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (for 0.3% solution)</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>CarlRoth</td><td>4227.3</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;H2AX antibody (rabbit)</td><td>CellSignalling</td><td>2577S</td><td>1:200으로 희석</td></tr></tbody></table>
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테르트-부틸 하이드로퍼옥사이드를 이용한 스트레스 유발 조기 노화 유도 프로토콜

A Standardized Protocol for Inducing Stress-Induced Premature Senescence in Primary Human Melanocytes Using Tert-butyl Hydroperoxide

Environmental stressors, including UV radiation, air pollution, or cigarette smoke, drive extrinsic skin aging. Exposure to these extrinsic aging factors ...

본 연구는 멜라닌 세포의 노화 표현형과 그것이 외인성 피부 노화에 기여하는 영향을 조사하는 데 중점을 둡니다. 기존의 노화 모델은 섬유아세포를 사용하므로 멜라닌 세포 특유의 생물학적 특성을 포착하지 못합니다. 본 프로토콜은 일차 배양된 인간 멜라닌 세포에 tBHP 매개 산화 스트레스를 유도합니다.먼저, 필요한 시약을 준비합니다. 멜라닌 세포를 해동하고 3일 동안 회복시킨 후, 세포 파종 당일에 세포 밀도가 80~90% confluency에 도달했는지 확인하십시오. 플라스크에서 배지를 흡입하여 제거합니다.DPBS로 세포를 두 번 세척합니다. 세포를 분리하기 위해 trypsin EDTA 용액 2 mL를 첨가합니다. 플라스크를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에 5분 동안 둡니다.플라스크를 가볍게 두드립니다. 현미경으로 세포를 관찰하여 완전히 분리되었는지 확인합니다. 반응을 중단시키기 위해 트립신 억제제(trypsin inhibitor)를 부피의 1.5배만큼 첨가합니다.세포 현탁액을 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. DPBS를 사용하여 현탁액을 최종 부피 10밀리리터가 되도록 희석합니다. 세포 현탁액을 100의 상대 원심력으로 5분 동안 원심 분리합니다.상층액을 흡입하여 제거하고, 세포 펠렛을 원하는 부피의 배지에 다시 현탁합니다. tert-Butyl hydroperoxide(tBHP) 처리 플레이트의 경우 10 centimeter 디쉬당 600, 000개의 세포를 분주합니다. 대조군 플레이트의 경우 플레이트당 400, 000개의 세포를 분주합니다.DPBS 또는 배지를 사용하여 tBHP 스톡으로 10 millimolar 작업 용액을 준비합니다. 처리당 100 micromolar tBHP를 세포에 첨가하고 1시간 동안 처리합니다. 플레이트를 앞뒤로 움직여 tBHP가 배지 전체에 고르게 분산되도록 합니다.세포를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 인큐베이터에 정확히 1시간 동안 배양합니다. tBHP 처리를 종료하기 위해 배지를 흡입하여 제거합니다. 37 °C로 예열된 DPBS로 플레이트를 두 번 세척합니다.플레이트에 적절한 부피의 신선한 배지를 추가합니다. 플레이트를 배양기에 넣고 다음 처리 전까지 세포가 최소 4시간 동안 회복되도록 합니다. 당일 중으로 처리 절차를 반복하여 2차 처리를 수행합니다.4일까지 처방 요법을 계속한 다음, 노화 마커를 평가하기 위해 9일까지 세포 배양을 유지합니다. tBHP 처리 세포와 대조군 세포의 수를 측정합니다. 초기 밀도와 동일하게 세포를 다시 파종하거나, tBHP 처리 플레이트에서 얻은 세포가 600, 000개 미만인 경우 수집된 모든 세포를 다시 파종합니다.배양 4일, 9일, 15일에 세포 수를 측정합니다. 9일째에 PBS로 세포를 2회 세척합니다. 2% formaldehyde와 0.4% glutaraldehyde를 사용하여 세포를 고정합니다.고정된 세포를 PBS로 두 번 세척합니다. 고정된 세포를 pH 6의 염색 용액에서 배양합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 덮은 후, 이산화탄소가 없는 상태에서 37 °C로 18시간 동안 배양합니다.PBS로 세포를 두 번 세척하십시오. 광학 현미경을 사용하여 청색으로 염색된 세포의 수를 촬영하고 계수하십시오. 이를 동일 시야 내의 총 세포 수로 나눕니다.결과를 양성 세포의 백분율로 표시하십시오. 산화적 스트레스 유도 후, tBHP 처리는 대조군에 비해 멜라닌 세포의 증식을 유의하게 감소시켰습니다. 처리된 세포는 9일 차까지 누적 세포 분열 횟수인 cPDL이 1.4에 불과했던 반면, 대조군은 3.1 cPDL에 도달했습니다.15일째에 처리된 세포는 1.9 cPDL에서 정체된 반면, 대조군 세포는 5.1 cPDL까지 증식했습니다. tBHP 처리된 멜라닌세포는 측정된 모든 시점에서 대조군에 비해 세포 표면적이 증가했으며, 이러한 확대는 15일까지 진행되었는데, 이는 노화 세포의 확대 및 평탄화된 형태와 일치합니다. tBHP 처리된 멜라닌세포는 노화 관련 베타-갈락토시다제(SA-beta-galactosidase) 활성의 증가를 보였으며, 대조군의 3%에 비해 32%의 양성 세포가 관찰되었습니다.SA-beta-galactosidase 양성 반응의 증가는 노화 표현형과 일치하였습니다. 면역형광 분석 결과, 대조군에 비해 tBHP 처리된 멜라닌 세포에서 gamma-H2AX 수치가 증가한 것으로 나타났습니다. 처리된 세포는 대조군보다 더 강한 gamma-H2AX 신호를 보였습니다.실시간 정량 PCR 분석 결과, 노화 관련 분비 표현형 인자의 발현이 증가했으며, 그 중 interleukin-8의 증가 폭이 가장 컸습니다. 반면 interleukin-6와 matrix metalloproteinase-1은 중간 정도의 증가를 보였습니다. Western blot 분석을 통해 노화 유도를 확인하였습니다.tBHP 처리된 멜라닌 세포에서는 대조군과 비교하여 Lamin B1이 유의하게 감소했습니다. tBHP 처리된 멜라닌 세포에서는 대조군과 비교하여 인산화된 retinoblastoma 단백질 수준이 감소했습니다. tBHP 처리는 멜라닌 세포에서 p16 및 p21의 전사 발현을 증가시켰습니다.이 모델을 통해 연구자들은 노화된 멜라닌 세포가 색소 침착에 어떠한 영향을 미치는지, 그리고 SASP 염증 인자를 통해 주변 세포와 어떻게 소통하는지 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜의 핵심 과제는 정확한 타이밍입니다. tBHP는 최소 4시간의 간격을 두고 하루에 두 번 처리해야 합니다.이 프로토콜에 따라, 노화 관련 베타-갈락토시다아제(senescence-associated beta-galactosidase) 염색, 면역형광법, RT-qPCR 및 확립된 노화 마커의 웨스턴 블롯팅을 이용하여 노화 특성을 규명할 수 있습니다.

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연구

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Biology

생물학

이 비디오는 인간의 피부를 모방한 마우스 모델인 인간화 마우스 모델에서 UV 감도를 측정하는 방법을 설명합니다. 우리는 피부에 홍반 또는 부종을 유발할 수 있는 UV 방사선의 최소 홍반량(MED)을 결정합니다. 이 방법은 자외선 민감성을 줄이는 데 사용되는 약물의 효능을 알아내는 데 도움이 될 수 있습니다.

최소 홍반성 선량 분석: 마우스 모델에서 UV 감도를 측정하는 방법

표피의 멜라닌은 공정한 피부가 자외선에 민감한 인간의 쥐 모델 포스 콜린의 국소 응용 프로그램에 의해 유도된다. 최소 홍반 량 (MED) 분석에 의해 측정 된 강력한 UV-매개 성 염증 (자외선)으로부터 보호 어둡게 피부 표피에있는 캠프 수준의 약리학적인 조작.

인간 답게 된 마우스 모델에서 표피 멜라닌 및 보호에 대하여 햇볕의 약물 유도

이 작품은 신경 능선을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 색소, 성숙한 멜라닌 세포를 생산하고 공급이없는 25 일간의 프로토콜을 사용하여 중간 단계 멜라닌하는 체외 분화 프로토콜을 설명합니다.

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

여기, 우리 유도 대 한 프로토콜의 시리즈 및 경작된 한 세포에 세포 노화의 유효성 검사를 설명합니다. 우리는 다른 노화 유도 자극에 집중 하 고 일반적인 노화 관련 마커의 정량화를 설명. 우리 모델, 섬유 아 세포를 사용 하 여 기술 정보를 제공 하지만 프로토콜은 다양 한 휴대 전화 모델에 적용할 수 있습니다.

유도 및 기본 인간 세포에서 세포 노화의 유효성 검사

다음 절차는 유전자 조작 된 마우스 모델을 사용 하 여 뮤 린 등 피부에 멜 라 세포 종양 개시의 공간적 및 시간적 제어를 위한 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 거시적 뿐만 아니라 현미경 피부 흑색 종 개시를 설명 합니다.

돌연변이 멜 뮤 린 줄기 세포에서 시작 하는의 공간적 및 시간적 제어

이 프로토콜의 목적은 마우스 피부에서 치명적이지 않은 수준의 활성 산소 종(ROS)의 일시적인 생체 내 생산을 유도하여 조직의 생리적 반응을 더욱 촉진하는 것입니다.

활성 산소 종의 전환 가능한 protoporphyrin IX 의존성 광생성에 의한 마우스 피부의 줄기 세포 틈새 및 조직 재생 자극 in situ

이 논문은 TIVA 배지에 Y-27632를 첨가하면 성인 피부 조직에서 멜라닌세포의 수율을 크게 증가시킬 수 있다고 보고합니다.

Y-27632 성인 피부 조직에서 인간 멜라닌 세포의 수율을 강화

우리는 H 2O2로망막 색소 상피 세포를 치료하여 세포 형태, 생존가능성, 밀도, 글루타티온 및 UCP-2 수준의 개발 및 사용을 위한 프로토콜을 제시합니다. 신경망 변성을 치료하기 위해 트랜스포슨-감염된 세포에 의해 분비되는 단백질의 항산화 효과를 조사하는 데 유용한 모델이다.

수면 의 아름다움 트랜스포슨 - 전염 인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스의 유도 및 분석

여기에서는 멜라노사이트를위한 최적화 된 직접 재 프로그래밍 시스템과 원활한 직접 재 프로그래밍을 보장하는 고효율, 집중 바이러스 포장 시스템에 대해 설명합니다.

마우스 섬유아세포를 멜라노세포로 직접 재프로그래밍

이 방법은 노화된 피부 섬유아세포가 건강한 피부에 미치는 영향을 연구합니다. 노화는 UVB 노출로 유도되며, 조절된 배지를 정상적인 섬유아세포에 적용합니다. 피부 노화 과정에서 세포 간 소통 변화를 표적으로 하는 생리활성 화합물을 평가하는 데 도움을 줍니다.

노화 세포에서 조건화된 배지를 이용한 시험 관 내 모델 내 건강한 세포 간 소통 복원을 위한 항산화제의 새로운 조합

Universität Innsbruck.  tBHP를 이용한 HNM 조기 노화 유도 표준화 프로토콜, 성장 정지, SA-β-갈락토시다제 활성, SASP 인자 등 주요 노화 지표 분석의 표준화 프로토콜.

테르트-부틸 하이드로퍼옥사이드를 이용한 스트레스 유발 조기 노화 유도 프로토콜

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