영양소가 낮고 변동하는 상태에서 대 장 균 연구를 위한 연속 배양 밀리플루이딕 장치

저의 연구는 박테리아가 자연 환경의 저격하고 변동하는 영양 조건에 생리적으로 어떻게 적응하는지를 연구하는 데 중점을 두고 있습니다. 기존 재배 시스템은 저동적 영양분 조건을 잘 재현하지 못하는 반면, 우리 시스템은 이러한 환경 관련 조건에서 재배를 가능하게 합니다. 실험 전날에 하룻밤 배양을 준비하세요.

6밀리리터의 완전 풍부 정의 배지(RDM)가 들어있는 튜브에 하룻밤 배양 6마이크로리터를 첨가하여 전배양을 준비합니다. 혼합물을 15밀리리터 배양관 두 개로 균등하게 나누고 A와 B로 라벨링하세요. 두 튜브를 37도 섭씨에서 배양하고, 200 RPM에서 흔들어 보세요. 600나노미터에서 B관을 사용해 광학 밀도를 모니터링하고, 광학 밀도가 약 0.5에 도달할 때까지 진행하지 마세요.

인큐베이션 중에는 저 RDM 배지를 준비하고, 각 병에 걸쳐 총 부피를 서로 다른 시간대에 할당하세요. 그 다음 각 병을 세 개의 튜브가 달린 캡으로 밀봉합니다. 세 번째로 넓은 실리콘 튜브를 0.2마이크로미터 통풍 필터에 연결해 멸균 공기 교환을 합니다.

각 연동 튜브의 한쪽 끝은 수컷 루어 락 커넥터가 장착된 작은 직경의 실리콘 튜브에 부착합니다. 실험이 시작될 때까지 연동 튜브 반대편에 있는 자유로운 수성 루어 잠금 피팅에 알루미늄 호일 덮개를 그대로 두어 오염을 방지하세요. 병과 연동 펌프를 37도 섭씨로 설정한 인큐베이터에 넣으세요.

모든 연동 튜빙을 동일한 펌프 헤드의 채널에 고정하여 모든 필터에서 동일한 유량을 유지하세요. 5.4밀리리터의 저 RDM이 들어있는 튜브에 600마이크로리터의 배양물을 넣어 1대 10 비율로 전배양물을 희석합니다. 1밀리리터 피펫을 사용해 희석된 배양 양을 6개의 0.45마이크로미터 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 필터 각각에 주입합니다.

일방향 체크 밸브를 오토클레이드 초순수수로 헹구고, 필터 양 끝에 부착하세요. 튜브 피팅에서 알루미늄 호일 커버를 제거하세요. 각 필터를 연동 튜빙 피팅에 연결하세요.

연동 펌프의 유량을 분당 2밀리리터로 설정하세요. 필터 아래에 폐기물 수로를 설치해 유출물을 모으고 흐름을 시작하세요. 2시간 후, 1리터 병에 연결된 필터 중 하나를 뽑고, 일방향 체크 밸브를 풀어 필터를 50밀리리터 원심분리관에 넣어 입구가 아래를 향하게 합니다.

원심분리기 2,000G에서 2분간 사용. 멸균된 파이프 커터를 사용해 플라스틱 케이스의 출구 끝을 부드럽게 눌러 필터를 열어라. 내부 실린더를 해제하고 막을 포함하는 부분을 버립니다.

채취된 배양액으로 필터 케이싱 내부 벽을 씻어내세요. 5밀리리터 혈청학적 피펫을 사용해 총 수집 부피를 측정합니다. 샘플에서 100마이크로리터 알리코트 세 개를 취해 글루타알데히드로 최종 농도가 1.5%로 고정한 후 해당 필터를 분리한 후 채취 과정을 반복합니다.

채취한 샘플을 각 시점에 따라 라벨을 붙이세요. 형광 DNA 염료로 샘플을 표지하고, 유세포분석을 이용해 세포 수를 세세요. 시간이 지나면서 로그 10개의 변환된 셀 수는 선형 궤적을 따라 모든 조건에서 지수적 성장을 나타냈다.

성장률은 0.5% RDM 조건에서 시간당 약 0.88, 0.25% 조건에서 시간당 0.64, 0.01% 조건에서 시간당 약 0.18이었습니다. 세포 수는 샘플당 최대 10억 개의 세포에 달했으며, 밀리플루이딕 연속 배양 장치(MCCD)가 나노몰에서 미세몰 영양소 농도에서 기하급수적 성장과 높은 바이오매스 생산량을 모두 지원함을 보여줍니다. 0.5% RDM에서 배양된 세포는 0.01% RDM에서 배양된 세포보다 평균 세포 길이가 더 길었습니다.

저영양 배양 시 주요 과제는 막힘, 압력 축적, 영양분 고갈을 방지하기 위해 적절한 세포 밀도를 유지하는 것입니다. 이 절차를 거쳐 세포를 수확하여 단백질체학, 대사체학, 기타 오믹스 접근법 등 후속 분석을 수행할 수 있습니다. 향후 연구에서는 이 프로토콜을 정량적 옴 분석과 통합하여 영양소 제한 및 변동에 대한 미생물의 적응을 조사할 수 있습니다.