Name: 잠재적 항결핵 후보 식별: 포유류 세포에서 합성, MIC 결정 및 세포독성 평가에 대한 단계별 가이드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-22T12:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 학습하세요 항결핵 후보 약물의 합성, MIC 결정 및 세포독성 평가 방법을 통해 Mycobacterium tuberculosis에 대한 선택적 치료제를 식별하고 선별 지수를 계산하여 신약 개발의 기초를 마련하는 체계적인 프로토콜을.

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<ol><li>Pai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis.</a> Nat Rev Dis Primers. 2, 16076(2016).</li>
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<li>Franzblau, S. G., DeGroote, M. A., Cho, S. H., Andries, K., Nuermberger, E., Orme, I. M., Mdluli, K., Angulo-Barturen, I., Dick, T., Dartois, V., Lenaerts, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+methods+used+for+the+evaluation+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinburgh%2C+Scotland%29%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis (Edinburgh, Scotland). 92 (6), 453-488 (2012).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>세포주</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HepG2 (human hepatocellular carcinoma)</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>Human liver carcinoma cell line</td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37Ra</td><td>ATCC</td><td>25177</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37Rv</td><td>ATCC</td><td>27294</td><td></td></tr><tr><td>Vero (African green monkey kidney)</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>Primate kidney epithelial cell line</td></tr><tr><td>화학물질 &ndash; 합성</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-(Piperidin-1-yl)aniline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TCI: P0887</td><td>Amine precursor for compound 5/6</td></tr><tr><td>4-Bromoaniline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108-67-8</td><td>Starting material for quinoline synthesis</td></tr><tr><td>Acetic acid (glacial)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>Reagent in synthesis and mobile phase preparation</td></tr><tr><td>Acetonitrile (HPLC grade)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967</td><td>HPLC mobile phase component and NMR solvent</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Solvent for product extraction</td></tr><tr><td>DMSO-d6 (deuterated)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>175641</td><td>NMR solvent</td></tr><tr><td>Dowtherm A (heat transfer fluid)</td><td>Sigma-Aldrich / Solutia</td><td>TBD</td><td>High-boiling solvent for thermal cyclization (230&ndash;250 &deg;C); formerly listed as Dowtherm&reg; A</td></tr><tr><td>Ethanol (absolute)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>Reaction solvent for Conrad&ndash;Limpach step</td></tr><tr><td>Ethyl acetate (HPLC grade)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270989</td><td>Column eluent component</td></tr><tr><td>Ethyl acetoacetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E12806</td><td>&beta;-ketoester reagent for quinoline ring formation</td></tr><tr><td>Formic acid (HPLC grade)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td>0.1% additive in mobile phase for HPLC and HRMS</td></tr><tr><td>Glass beads (1 mm, sterile)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>For homogenization of M. tuberculosis culture</td></tr><tr><td>HCl (hydrochloric acid, 37%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Acid catalyst in nucleophilic substitution</td></tr><tr><td>Hexane (HPLC grade)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34859</td><td>Non-polar eluent for column chromatography</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>278475</td><td>Reaction solvent for synthesis of compound 6</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate (MgSO4, anhydrous)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>Drying agent and reaction catalyst</td></tr><tr><td>Methanol (HPLC grade)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>HPLC mobile phase and NMR solvent component</td></tr><tr><td>Phosphorus(V) oxychloride (POCl3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td>Chlorination reagent for intermediate 4</td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>Base catalyst in nucleophilic substitution</td></tr><tr><td>Silica gel (35&ndash;70 mesh) for flash chromatography</td><td>Macherey-Nagel</td><td>815349</td><td>Stationary phase for flash chromatography steps</td></tr><tr><td>Silica gel 60 &Aring; (70&ndash;230 mesh) for column chromatography</td><td>Macherey-Nagel</td><td>815381</td><td>Stationary phase for column chromatography</td></tr><tr><td>Sodium sulfate (Na2SO4, anhydrous)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td>Drying agent for organic phase</td></tr><tr><td>TLC Silica gel 60 F254 plates</td><td>Merck</td><td>1.05554</td><td>Thin-layer chromatography monitoring</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>Solvent for chlorination step</td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Millipore / equivalent</td><td>N/A</td><td>Used in mobile phase preparation; formerly referenced as Milli-Q water in text</td></tr><tr><td>장비 및 기기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro;m syringe filter</td><td>Millipore / any</td><td>SLGP033RS</td><td>Sterilization of resazurin solution (2.1.4); filtration of MTT working solution (3.3); filtration of Neutral Red working solution (3.4)</td></tr><tr><td>0.45 &micro;m syringe filter</td><td>Millipore / any</td><td>SLHA033SS</td><td>Filtration of mobile phase solutions</td></tr><tr><td>15 mL conical tube (sterile)</td><td>Falcon / any</td><td>352097 or equivalent</td><td>Collection and centrifugation of cell suspension after trypsinization</td></tr><tr><td>96-well plate (flat bottom, tissue culture treated)</td><td>Corning / any</td><td>3596</td><td>For cytotoxicity and MIC assays</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td>Any</td><td>&mdash;</td><td>Light protection of plates during MTT and NRU incubation and shaking steps</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Any</td><td>&mdash;</td><td>Sterilization of media (121 &deg;C, 98.07 kPa, 10 min)</td></tr><tr><td>Biosafety cabinet (Class II, certified)</td><td>Any (BSL-3 certified)</td><td>&mdash;</td><td>Required for M. tuberculosis manipulations (BSL-3)</td></tr><tr><td>Cell counter (automated) or hemocytometer</td><td>e.g., Bio-Rad TC20 / Neubauer</td><td>TBD</td><td>For cell concentration and viability determination</td></tr><tr><td>Centrifuge (capable of 200 &times; g)</td><td>Any</td><td>&mdash;</td><td>Cell pelleting step</td></tr><tr><td>CO2 incubator (37 &deg;C, 5% CO2, humidified)</td><td>Any</td><td>&mdash;</td><td>Cell culture and treatment incubation</td></tr><tr><td>Heating mantle</td><td>Fisotom&nbsp;</td><td>12M</td><td>Temperature-controlled heating mantle with Dowtherm&reg; A</td></tr><tr><td>HPLC system (Dionex UltiMate 3000)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5035.9200</td><td>Dual pump, automatic injector, UV detector; for purity analysis of compound 6</td></tr><tr><td>Inverted microscope (or equivalent)</td><td>Any</td><td>&mdash;</td><td>Visual inspection of cells at attachment (3.2), during treatment checkpoint (3.3, 3.4), and for assay status verification</td></tr><tr><td>Magnetic stirrer / hotplate</td><td>Any</td><td>&mdash;</td><td>Solution preparation and reaction mixing</td></tr><tr><td>Mass spectrometer (LTQ Orbitrap Discovery)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&mdash;</td><td>High-resolution Orbitrap combined with LTQ XL; for HRMS of compound 6</td></tr><tr><td>Melting point apparatus</td><td>Any (e.g., Stuart SMP10)</td><td>&mdash;</td><td>Melting point determination of compound 6</td></tr><tr><td>Microplate reader (absorbance)</td><td>Any (e.g., BioTek Epoch)</td><td>&mdash;</td><td>Reads absorbance at 570 nm (MTT) and 540 nm (NRU)</td></tr><tr><td>NMR spectrometer (Avance III HD, 400 MHz)</td><td>Bruker Corporation</td><td>N/A</td><td>1H and 13C NMR acquisition; located at PUCRS facility</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Any</td><td>&mdash;</td><td>100 rpm (MTT crystal dissolution); 150 rpm (NRU extraction)</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis / Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>Sealing of 96-well plates during incubation</td></tr><tr><td>Qualitative filter paper</td><td>UNIFIL</td><td>50,11,250</td><td>Whatman Grade, cellulose; 11 &micro;m retention; ~80 g/m&sup2;</td></tr><tr><td>Reverse

잠재적 항결핵 후보 식별: 포유류 세포에서 합성, mic 결정 및 세포독성 평가에 대한 단계별 가이드

Identification of Potential Anti-TB Candidates: A Step-by-Step Guide to Synthesis, MIC Determination, and Cytotoxicity Assessment in Mammalian Cells

잠재적 항결핵 후보 식별: 포유류 세포에서 합성, MIC 결정 및 세포독성 평가에 대한 단계별 가이드

Tuberculosis (TB) remains one of the leading causes of death from a single infectious agent worldwide, with rising rates of drug resistance making the ...

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

우리는 세포를, 결핵균에 대해 신규 한 화합물을 발견 타겟팅 및 인스 국물 포유 동물 숙주 세포에 대해 박테리아뿐만 아니라 세포 독성이 증가하는 모듈 높은 처리량 스크리닝 시스템을 개발 하였다.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

프로토콜 WEHI 164 셀 중립화 메커니즘을 사용 하는 안티-TNFα mAb의 상대 안티-apoptotic 활동의 결정에 대 한 여기에 제공 됩니다. 이 프로토콜은 같은 생물 학적 기능을 가진 다른 분자의 중립화 강도 비교 하는 데 유용.

상대적인 힘의 안티-TNF 단 클론 항 체 (mAb) 중화 방 청 TNF는 시험관에서 생물 메서드를 사용 하 여의 결정

차세대 항결핵 약물을 위한 초기 약물 개발 과정을 개선할 수 있는 새로운 모델과 분석이 매우 바람직합니다. 여기에서는 고처리량 스크리닝에 쉽게 적용할 수 있는 결핵균에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 빠르고 저렴한 BSL-2 호환 분석에 대해 설명합니다.

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em&gt; 결핵균</em

이 프로토콜은 표적 결합 및 보체 의존성 세포 독성 (CDC) 유도와 같은 리툭시 맵의 두 가지 중요한 기능적 특성 에 대한 시험관 내 비교를 설명합니다. 상기 방법은 기준 리툭시 맵과 리툭시 맵 바이오시 밀러 사이의 일대일 비교를 위해 사용되었다. 이러한 분석법은 바이오시 밀러 개발이나 생산 과정에서의 품질 관리에 사용될 수 있습니다.

체외 방법에서 대상 바인딩 및 치료 항체 사이 CDC 유도 비교 : 응용 프로그램 생물학적 동등성 분석에

이 문서는 준비와 다양 한 immunoassays에 사용 하기 위해 천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 평가 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 절차는 면역을, 세포 융합, 간접 경쟁 ELISA, 긍정적인 복제품와 단일 클로 널 hybridoma 준비를 포함 한다. MALDI – TOF-MS와 ELISA 분석을 사용 하 여 항 체 특성에 대 한 사양도 제공 됩니다.

천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성

이 프로토콜 설명 합니다 자세한 워크플로 생성에 대 한 immunomodulators, 예를 들어 bispecific T 세포 engagers를 인코딩 하는 홍 역 바이러스를 사용 하 여 표현 위한 oncolytic 바이러스의 비보 특성화 전. 응용 프로그램 및 다른 벡터 플랫폼 및 transgenes 적응 임상 번역 소설 immunovirotherapeutics의 개발을 가속화할 것 이다.

종양 대상 Immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보

세포 내 M. 결핵 성장의 신속하고 효율적인 정량화는 결핵(TB)에 대한 개선된 치료법을 추구하는 데 중요합니다 . 이 프로토콜은 후보 숙주 지시 요법으로 처리된 대식세포에서 Mtb 성장을 정량화하기 위해 자동화된 액체 배양 시스템을 사용하는 브로스 기반 비색 검출 분석을 설명합니다.

결핵에 대한 숙주 유도 요법의 전임상 테스트에 사용하기 위한 자동화된 배양 시스템

콜로니 형성 단위(CFU)의 측정은 눈에 보이는 콜로니를 형성하는 데 몇 주가 걸릴 수 있는 Mycobacterium tuberculosis를 포함하여 박테리아를 정량화하기 위한 황금 표준 기술입니다. 여기서는 시간 효율성 향상, 실험실 공간 및 시약 비용 절감, 중간 및 고처리량 실험으로의 확장성을 갖춘 CFU 측정을 위한 마이크로 CFU에 대해 설명합니다.

결핵에 대한 백신의 효능 평가를 위한 Micro-colony Forming Unit Assay

이 연구는 박테리아 생존력을 신속하게 평가하기 위해 형광 및 발광을 사용하여 최근에 생성된 이중 리포터 균주를 사용하여 Mycobacterium abscessus 에 대한 고처리량 스크리닝을 위한 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜은 이 약물 내성 박테리아에 대한 신약을 스크리닝하려는 연구자들과 관련이 있습니다.

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