잠재적 항결핵 후보 식별: 포유류 세포에서 합성, MIC 결정 및 세포독성 평가에 대한 단계별 가이드

우리 연구의 초점은 치료 전략을 발전시키기 위한 새로운 항결핵 약물 후보의 개발 및 검증에 있습니다. 예방적 표현형 선별 파이프라인은 결핵균주에 대한 새로운 의약품 탐색에 활용될 수 있습니다. 우선, 필요한 시약을 모으고 제시된 비율로 반응 혼합물을 준비합니다.

반응 혼합물을 섭씨 85도에서 16시간 동안 저어줍니다. 용매를 제거하려면 회전 증발기를 사용하세요. 잔류물에 약 20밀리리터의 포화 중탄산나트륨 용액을 첨가합니다.

이 현탁액은 11마이크로미터 셀룰로오스 정성 여과지를 사용해 잔류 고형물을 수집합니다. 잔류 고형물을 50밀리리터의 클로로포름에 녹입니다. 분리용 깔때기를 사용해 클로로포름 용액을 15밀리리터의 물로 세 번 헹구세요.

매번 물층을 제거하고, 유기상에 무수황산나트륨을 넣어 잔여물을 제거하고 건조시킵니다. 용매를 증발시킨 후, 생성된 녹색 고형물을 약 50도 섭씨에서 10밀리리터의 뜨거운 헥산으로 네 번 세척합니다.

화합물 6 1밀리그램에 아세토니트릴과 메탄올의 1:1 혼합물을 1밀리리터 첨가하여 스톡 용액을 만듭니다. 분석 전에 정액을 0.5밀리그램/밀리리터로 희석하고 필터링하세요. 샘플을 HPLC 시스템에 넣으세요.

크로마토그래피 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집하고 처리하세요. 크로마토그래피 방법을 250 x 4.6 밀리미터 역상 C18 컬럼, 입자 크기 5마이크로미터로 설정하라. 유량을 분당 1.5밀리리터로 설정하고, 자외선 감지는 254나노미터로 설정하세요.

프로그래밍된 이동 위상 조성 변화로 제시된 그라디언트를 설정하세요. 약 15에서 20밀리그램의 화합물 6을 핵자기공명 또는 NMR 튜브에 전달합니다. 적절한 양의 DMSOD6에 녹여 주세요.

획득 매개변수가 제시된 대로 설정되면, 표준 펄스 시퀀스를 사용하여 양성자 NMR 스펙트럼을 획득합니다. 획득 매개변수를 조정하세요. 양성자 및 탄소 13 NMR 스펙트럼을 시작하고 화학 변화를 백만분의 한 단위로 보고합니다.

실험에서 얻은 자유 유도 붕괴 파일을 사용하여 NMR 데이터를 시각화하고 처리하세요. 화합물 6의 크로마토그래피 기반 정제를 위해서는 실리카겔로 컬럼을 채웁니다. 조잡한 화합물 6을 컬럼에 적재하세요.

화합물을 희석하고 분획을 수집하세요. 얇은 층 크로마토그래피를 사용해 분획을 모니터링하고 순수 생성물을 포함하는 분획을 결합합니다. 96웰 플레이트 12번 컬럼에 10% 알부민 덱스트로스 카탈라제 또는 ADC를 보충한 7H9 육수 100마이크로리터를 추가합니다.

그 다음 10%ADC와 5%DMSO가 포함된 7H9 육수 100마이크로리터를 11번 컬럼에 옮깁니다. 그리고 9열부터 1열까지 순차적으로 진행합니다. 화합물 용액 200마이크로리터를 10열에 추가하고, 화합물당 한 행씩 할당합니다.

96웰 플레이트 중 12번 컬럼에 100마이크로리터의 화합물 용액을 최고 시험 농도의 두 배로 피펫 주입합니다. 10번 컬럼에서 9번 컬럼으로 100마이크로리터를 옮기고, 피펫팅으로 잘 섞어 두 배 희석을 시작합니다. 연속 희석을 1열까지 순차적으로 계속하세요.

11번 기둥에서 1번 기둥까지 100마이크로리터의 결핵균 박테리아 현탁액을 차례로 첨가한 후 플레이트를 덮습니다. 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 37도 섭씨에서 7일간 배양하세요. 다음으로, 플레이트의 각 웰에 0.01%레사주린 용액 60마이크로리터를 넣고 덮습니다.

플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 37도 섭씨에서 48시간 배양하세요. 그 다음 파란색에서 분홍색으로 색이 바뀌는지 확인하세요. 혈청 무첨가 DMEM에서 0.5밀리그램/밀리리터 MTT 용량의 작동 용액을 준비합니다.

화합물 6으로 처리한 Vero 및 HEPG2 세포를 48시간 동안 검사하여 치료 효과를 평가합니다. 판에서 매질을 흡입한 후, 각 우물에 50마이크로리터의 MTT 작업 용액을 낮은 환경에서 첨가합니다. 3시간 배양 후에는 각 우물에 100마이크로리터의 DMSO를 첨가하여 저조도 조건에서 포마잔 결정체를 용해합니다.

플레이트를 100RPM의 궤도 셰이커에 15분간 올려놓고 빛으로부터 보호하세요. 제어 우물을 점검하여 완전한 결정 용해를 확인하세요. 플레이트를 마이크로플레이트 리더기에 넣으세요.

기준 파장을 630에서 690나노미터로 설정하고 570나노미터에서 흡광도를 확인하세요. 혈청 무첨가 DMEM에서 40마이크로그램/밀리리터 중성 적색 작업 용액을 준비합니다. 그 다음 1%의 빙하 아세트산, 49%의 에탄올, 50%의 초순수수를 포함한 중성 적색 탈착 용액을 준비합니다.

화합물 6의 효과가 Vero 및 HEPG2 세포에 평가되면, 배지를 제거하고 각 웰에 여과된 중성 적색 작업 용액 100마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 2시간 동안 배양하세요. 중성 적색 작업 용액을 제거한 후, 각 웰을 150마이크로리터 무균 PBS로 한 번씩 세척합니다.

각 우물에 중성 적색 탈착 용액 150마이크로리터를 추가하세요. 염료를 추출하기 위해 15분 동안 150RPM의 궤도 셰이커에 판을 올려놓습니다. 조준 우물을 점검하여 염료 추출이 완전히 완료되었는지 확인하세요.

마이크로플레이트 리더기로 540나노미터에서 흡광도를 측정했습니다. HPLC 크로마토그램은 화합물 6의 보존 시간이 14.11분이고 순도가 99%임을 보여주었다. 양성자 NMR 스펙트럼은 피페리딘 모이에티에 대해 1.50에서 3.13ppm 사이의 특징적인 신호를 보였다. 메틸 싱글렛이 2.38ppm으로 나왔어요.

그리고 방향족 신호는 6.97과 7.17ppm, 다중항은 7.63에서 7.75ppm으로 나타납니다. 탄소 13 NMR 스펙트럼에서는 메틸 탄소 신호가 23.81ppm, 피페리딘 관련 신호는 24.85에서 49.70ppm 사이로 나타났습니다. MTT 플레이트는 화합물 농도에 걸쳐 명확한 색상 구배를 보여주었으며, 이는 반투명 웰이 있는 고농도에서 세포독성이 가장 높고, 깊은 보라색 웰이 있는 저농도에서 가장 낮음을 나타냈다.

중성 적색 흡수판은 화합물 농도에 걸쳐 명확한 색상 구배를 보여주었으며, 이는 반투명 웰이 있는 고농도에서 세포독성이 가장 높고, 깊은 분홍색 웰이 있는 저농도에서 가장 낮음을 나타냈습니다. 이 프로토콜은 표현형 선별을 기반으로 결핵 치료제 후보 개발을 위한 파이프라인을 의미합니다. 프로토콜을 적용할 때 합성 화합물의 낮은 용해도를 고려하고 평가하는 것이 중요합니다.

이 연구는 향후 생체이용률, 대식세포 감염 및 생체 내 연구의 기초가 될 수 있습니다.