Name: 유글레나 그라실리스를 카사바 기반 기질에 적응시켜 이영양 재배를 위한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: 학습하세요 카사바 기반 기질에 Euglena gracilis를 적응시키는 다단계 전략을 통해 이영양 재배를 수행하는 방법입니다. 이 프로토콜은 사이아노겐 화합물과 미생물 군집이 있는 복잡한 농산업 부산물에서도 강건한 조류 성장을 가능하게 합니다.

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<table><tbody><tr><td>Autoclave - 533LS Steam Sterilizer</td><td>Getinge</td><td>533LS</td><td>카사바 미디어의 증기 멸균. 액체 사이클을 사용하여 미디어 멸균.</td></tr><tr><td>Bright-Line&trade; Hemacytometer replacement cover slip</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR723015- 100EA</td><td>혈구계산기 사용을 위해 설계된 특수 두꺼운 커버슬립.</td></tr><tr><td>Cassava dried pulp</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>카사바 기질 제공</td></tr><tr><td>Cassava pellets</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>카사바 기질 제공</td></tr><tr><td>Cassava peels</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>카사바 기질 제공</td></tr><tr><td>Cassava substrate (garri)</td><td>Local supplier</td><td>N/A</td><td>카사바 파생 garri 탄소 원으로 사용; 디아이오나이즈드 워터로 준비됨.</td></tr><tr><td>Centrifuge Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifuge</td><td>Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifuge</td><td>75004241</td><td>&ge;3,500 &times; g 가능, 바이오매스 수확에 사용.</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes E.g. Axygen (A Corning Brand)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C-S</td><td>무균, 최소 1.5 mL 볼륨</td></tr><tr><td>Clean water E.g. UltraPure&trade; DNase/RNase- Free Distilled Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977035</td><td>디아이오나이즈드 또는 증류수. 미디어 준비에 사용</td></tr><tr><td>Compound light microscope</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>일상적인 세포 관찰 및 계수에 적합한 표준 복합 현미경.</td></tr><tr><td>Cyanide Test Strips, colorimetric. CN- 10-30 mg/L</td><td>MQuant</td><td>110044</td><td>반정량적 시안화물 검출. 유해 폐기물로 처리</td></tr><tr><td>Sterile Standard Weighing Boat</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-549-750</td><td>카사바 기질 및 건조 바이오매스 계량에 사용.</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (adapted lineage)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>이 연구에서 생성된 카사바 적응 주.</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (Wild-type)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>비적응 기준 주. 동일한 표준 조건을 유지.</td></tr><tr><td>Euglena growth medium components</td><td>Various</td><td>N/A</td><td>실험실 표준 제조법에 따라 준비된 기본 Euglena 미디어.</td></tr><tr><td>FreeZone 6 Liter Console Freeze Dryer</td><td>Labconco</td><td>70061xxxx</td><td>바이오매스 탈수에 사용</td></tr><tr><td>Hemocytometer with Standard Lines</td><td>Weber Scientific</td><td>NC1587539</td><td>수동 세포 계수에 사용.</td></tr><tr><td>Magnetic stirrer with hot plate</td><td>IKA</td><td>N/A</td><td>선택 사항; 미디어 준비 및 기질 현탁 중 일관성 향상.</td></tr><tr><td>Micropipettes (P20, P200, P1000)</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>무균 액체 이송에 사용되는 조정 가능 볼륨 피펫.</td></tr><tr><td>Mini-centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>선택 사항; 바이오매스 수확 중 빠른 펠렛화 용이.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>통풍 캡이 없을 때 플라스크나 플레이트의 임시 밀봉에 사용.</td></tr><tr><td>pH indicator strips</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-520</td><td>빠른 정성적 평가를 위한 미디어 pH 측정의 대체 pH 미터.</td></tr><tr><td>pH meter with probe Thermo Scientific Orion Star A211 Benchtop pH Meter</td><td>Thermo Scientific Orion Star A211 Benchtop pH Meter</td><td>13-645-519</td><td>사용 전 교정. 배양액 상층의 pH 측정</td></tr><tr><td>Refrigerated storage (4&deg;C)</td><td>Frigidaire</td><td>FRT18S6JW7</td><td>미디어의 단기 보관</td></tr><tr><td>Shaking incubator (dark)</td><td>Thermolyne</td><td>M49235</td><td>100&ndash;150 RPM 가능, 24&ndash;28 &deg;C 온도 범위; 밝은 조건 하에서 박테리아 성장을 지원하기 위해 암흑 조건에서 사용.</td></tr><tr><td>Spray bottle (32oz)</td><td>Boardwalk</td><td>BWK03010</td><td>벤치톱 멸균 및 일상적인 무균 처리(70% 에탄올 용액)에 사용</td></tr><tr><td>Spreadsheet software</td><td>Microsoft Excel</td><td>N/A</td><td>데이터 수집, 구성 및 분석</td></tr><tr><td>Sterile pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>P20, P200 및 P1000 피펫과 호환되는 무균, 일회용 팁.</td></tr><tr><td>Sterile serological pipettes (5, 10, 25 mL)</td><td>Corning</td><td>N/A</td><td>배양 전송 및 샘플�

유글레나 그라실리스를 카사바 기반 기질에 적응시켜 이영양 재배를 위한 방법

A Method for Adapting Euglena gracilis to Cassava-Based Substrates for Heterotrophic Cultivation

다음 대표적인 결과들은 설명된 프로토콜이 성공적으로 적용되었을 때 예상되는 결과와 최적이 아닌 조건에서 관찰된 결과 범위를 보여줍니다. 이러한 결과에 대응하는 대표 데이터는 그림 1, 그림 2, 그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6, 그림 7에 나와 있습니다. 이 결과들은 이영양 완전 암색 재배 조건에서 카사바 기반 기질에 E . gracilis 를 적응시킬 때 성장 역학, 생존 가능성, 형태학, 단백질 결과를 해석하는 데 실질적인 지침을 제공합니다. 더불어, 이 결과들은 성공적인 적응, 지속적인 성장, 높은 생존율, 안정적인 형태, 기질 간 일관된 성능, 측정 가능한 단백질 생산 등 프로토콜의 주요 생물학적 결과를 검증합니다.
실험 기간 동안 각 처리당 3개의 복제(모든 종류의 카사바 매체)가 사용되었습니다. 복제 개체 수는 위 프로토콜을 따르는 그룹의 재량과 물류 한계에 달려 있음을 인정합니다. 이 프로토콜을 성공적으로 적용하면 완전히 어두운 조건에서 가리 기반 배지에서 E. gracilis 가 지속적인 이종영양 성장을 이래합니다. 긍정적인 결과는 부드러운 시그모이드 성장 궤적, 복제체 간 확산이 제한적이며, 후기 세포 밀도가 안정적이라는 점이 특징입니다. 긍정적인 결과를 나타내고 적응한 집단에서 일관되게 관찰된 형태학적 특성으로는 세포의 둥근 형태와 두꺼운 세포막이 포함되었습니다. 반면, 건강하지 않은 붕괴 세포는 일반적으로 불규칙하거나 단편화되거나 구조적으로 손상된 모습을 보이며, 생존 능력이 저하된 것으로 나타나 적응된 배양에서 관찰되는 온전한 둥근 또는 반낭종 형태와 구별됩니다. 참고로, 특징적인 길쭉한 형태를 가진 야생형 E. gracilis 의 대표적인 이미지(그림 8)를 포함하여 기본 세포 구조와 적응 또는 변형된 형태를 구분합니다. 30g L-1 가리에서 배양된 배양은 낮은 농도에 비해 성장 곡선 아래 면적(AUC)으로 측정된 더 높은 통합 성장을 보였으며, 이는 카사바 기질의 더 효율적인 활용과 성공적인 생리적 적응을 시사합니다(그림 1).
부최적 결과는 일반적으로 낮은 가리 농도(10–20 g L-1)에서 관찰되며, 성장은 감지되지만 크기가 줄고 복제 간에 변동성이 더 큽니다. 더 높은 농도(40–50g L-1)에서는 배양 세포 밀도가 더 높아질 수 있습니다; 그러나 이러한 조건들은 종종 안정화 지연이나 시간적 변동성 증가를 보입니다(그림 2).
성공적인 실험에서는 세포 생존율이 배양 기간 내내 높게 유지되며, 실험 중 변동은 미미합니다. 트리판 블루 배제 검사는 30g L-1 가리로 유지된 배양에서 샘플 시점에서 생존 가능(염색되지 않은) 세포가 생존 가능(청색 염색) 세포에 비해 높은 비율을 유지함을 보여줍니다(그림 3). 염색 세포 비율 증가, 운동성 감소, 둥글거나 붕괴된 형태로의 이동 등 이 패턴에서 벗어나는 것은 최적의 상태가 아니라는 신호일 수 있으며, 초기 문제 해결의 계기가 될 수 있습니다. 생존 및 형태학적 평가는 세포 완전성, 방향성 운동성, 길쭉한 형태와 둥근 형태 또는 붕괴된 형태의 상대적 유병률 등 일관된 관찰 기준에 기반했습니다.
최적이 아닌 결과는 생존 가능성이 일시적으로 감소하는 것이 특징이며, 주로 가리 농도가 높은 곳에서 관찰됩니다. 부분 회복은 이후 시점에서 관찰될 수 있으며; 그러나 이러한 조건들은 배양 기간 전반에 걸쳐 생존 가능성의 변동성이 더 크게 나타납니다(그림 4). 이러한 성장 패턴은 중간 기질 농도(예: 30g L-1)가 영양소 가용성과 스트레스 사이의 균형을 제공하여 더 안정적인 성장을 가능하게 함을 보여줍니다. 이러한 경향은 전처리 조건과 단계적 적응이 배양 성능에 미치는 영향을 반영하며, 점진적으로 증가하는 기질 복잡성에 노출되면 생리적 안정성이 개선되고 재현 가능한 성장 행동이 유지됩니다. 농도가 낮을수록 바이오매스 생산이 제한되고, 농도가 높을수록 변동성이 커지고 안정화가 지연됩니다.
형태학적 평가는 적응 상태를 정성적으로 판단하는 지표를 제공합니다. 긍정적인 결과로는 운동성이 감소한 둥근 또는 반낭포 세포가 반복 하부 배양 후에도 유지되는 출현과 지속이 포함됩니다(그림 5).
반면, 야생형 균주나 초기 적응과 관련된 비최적화 배양은 길고 운동성 있는 세포에서 불규칙하거나 붕괴된 형태로 급격히 전환되어 성장 안정성이 감소하는 것을 보인다.
이 프로토콜을 펄프, 펠릿, 껍질 등 추가 카사바 유래 기질에 적용하면, 적응된 E. gracilis 배양균은 여러 기질 유형에서 재현 가능한 성장을 보입니다. 긍정적인 결과는 야생형 배양에 비해 성장 곡선이 더 일찍 안정화되고 후기 단계 감소가 감소한 것이 특징입니다(그림 6).
부최적 결과로는 성장 시작 지연이나 복제 변이성 증가가 있으며, 특히 물리적 이질성이 큰 기질에서 그렇습니다.
프로토콜의 성공적인 구현 결과, Combustion(Dumas) 방법을 이용한 외부 실험실 분석으로 측정 가능한 원단백질 함량을 가진 E. gracilis 의 생량이 산출됩니다. 적응된 배양에서 관찰된 단백질 비율은 야생형 배양과 유사하며, 총 단백질 생산량이 높을수록 바이오매스 축적이 증가합니다(그림 7).
배지 화학 모니터링은 적응 과정에서 배양-기질 상호작용을 지원했으며, 프로토콜 내 pH 및 시안화물 측정 포함 여부를 검증하였습니다. pH 값은 시간이 지남에 따라 점진적으로 변화하여 대사 활동과 기질 이용을 나타내며, 적응된 배양에서는 더 안정적인 추세를 보였습니다. 시안화물 측정도 이를 뒷받침하는데, 적응된 배양에서는 검출 가능한 농도가 감소한 반면, 야생형 배양은 더 변동성이 높았습니다. 이 결과들은 이러한 모니터링 단계들이 적응과 관련된 미디어 화학 변화를 효과적으로 포착하고 배양 성과에 대한 해석을 지원함을 보여줍니다. 기저 메커니즘은 조사되지 않았지만, 이는 특히 산업 규모 응용에서 향후 연구에 중요한 분야입니다.
장기적인 유지 및 통합된 작업 흐름은 적응된 Euglena gracilis 의 지속적인 생존 기간을 장기간 지원했습니다. 반복적인 계배를 통해 유지된 배양은 유지 주기 동안 운동성, 특징적인 형태, 안정적인 성장 행동을 일관되게 유지했습니다. 장기 성능은 정량적으로 평가되지 않았지만, 이러한 관찰은 적응된 계통이 지정된 조건 하에서 신뢰성 있게 유지될 수 있음을 대표하는 증거를 제공합니다.
이 결과들은 적응 프로토콜이 카사바 기반 기질에서 E . gracilis 의 견고한 성장, 생존 가능성, 바이오매스 생산을 지원하며, 일정한 성능과 시간이 지남에 따라 시안화물 수치 감소를 보인다는 것을 확인시켜 줍니다.
모든 도표와 도표는 별도의 파일로 제공되며 원고 문서에 내장되어 있지 않습니다. 그림 및 표 배치 선호는 원고 본문 내에서 괄호 안의 주석(예: (그림 1))으로 표시되어 있습니다. 별도 명시가 없는 한, 모든 수치와 표는 최종 출판물의 대표 결과 섹션 아래에 포함되도록 되어 있습니다.
모든 도표는 개별 파일로 제출되며, 다중 패널 도형은 하나의 통합 이미지로 제공됩니다. 현미경 이미지에는 각 패널에 스케일 바가 포함되어 있습니다. 데이터 수치에는 정의된 측정 단위가 표시된 축이 포함되며, 오차 바는 해당 도표 전례에 명시되어 있습니다.
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<img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
그림 1: 완전 어두운 조건에서 10, 20, 30 gL-1 garri에서 배양한 E. gracilis의 성장 역학. 각 기질 농도에 대해 시간에 따른 평균 세포 밀도가 나타납니다. 오차 막대는 생물학적 복제 전반에 걸친 SEM을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>
<img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
그림 2: 가리 농도가 높은 상태(30–50 g L-1)에서의 E. gracilis의 성장 성능. 세포 밀도 궤적은 기질 농도가 높은 시점에서 최대 밀도, 안정화 시기, 변동성의 차이를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>
<img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
그림 3: 30 gL-1 garri 배양 후 Trypan Blue 배제법으로 측정한 E. gracilis의 세포 생존 추세. 샘플링된 시점별로 생존 가능한 세포의 비율이 나타난다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>
<img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
그림 4: 더 높은 가리 농도에서 배양된 E. gracilis 의 생존 가능성 변동. 실험 기간 동안 세포 생존력의 일시적 변화가 나타난다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>
<img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig5.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 5"> 
그림 5: 적응한 E. gracilis 개체군의 대표적 형태. 대표적인 역 광경 현미경 이미지는 적응 후 둥근 반낭포 세포를 보여줍니다. 스케일 바 = XX μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.</a>
<img alt="그림 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig6.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 6"> 
그림 6: 적응형 및 야생형 E. gracilis 의 카사바 유래 기질에서의 성장 성과. 여러 카사바 제품을 재배한 적응형 및 야생형 배양의 성장 경로가 나타났습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>
<img alt="그림 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig7.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 7"> 
그림 7: 카사바 재배 E. gracilis 생체량의 원단백질 함량과 총 단백질 생산량. 단백질 함량은 SGS 연소(Dumas) 방법을 이용한 외부 분석으로 정량화되었습니다. 총 단백질 배출량과 바이오매스 축적량이 함께 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>
<img alt="그림 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig8.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 8"> 
그림 8: 표준 조건 하에서의 야생형 E. gracilis의 대표적 형태학(40배 배율). 건강한 비적응 Euglena gracilis 의 대표적인 이미지로, 광학 현미경에서 특징적으로 길쭉한 형태를 보입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>

Cassava processing generates nutrient-rich by-products that remain underutilized due to variable composition, cyanogenic compounds, and active microbial ...

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