유글레나 그라실리스를 카사바 기반 기질에 적응시켜 이영양 재배를 위한 방법

저희 연구는 새로운 Euglena gracilis의 잎을 카사바 폐기물에 적응시키고, 성장, 시안화물 저감, 단백질 풍부한 바이오매스 생산을 연구하는 데 중점을 둡니다. 이 프로토콜은 지속 가능한 카사바 가공, 농업 폐기물 가치화, 사료 생산, 저비용 생명공학 시스템에 적용될 수 있습니다. 우선, 멸균 500밀리리터 통풍 캡 플라스크에 기질 종류가 적힌 것을 garri라고 라벨링하세요.

플라스크에 적절한 목표 농도를 표시하세요. 복제 식별 및 계획된 멸균 상태가 적힌 플라스크에 고용멸균 또는 비고동균 상태로 표시하세요. 분석 저울에 무게를 올려놓으세요.

타레를 눌렀다가 가리를 최종 작동 부피에 맞게 무게를 재세요. 무균적으로 무게를 단 가리를 멸균된 500밀리리터 플라스크에 넣고, 그 플라스크에는 300밀리리터의 이온수 또는 증류수가 들어 있습니다. 각 플라스크에 통풍 캡을 다시 덮어주세요.

각 현탁액을 3분간 혼합하여 혼합물이 균질화됩니다. 자기 저어주기를 사용할 경우, 플라스크를 교반판 위에 올려놓고 속도를 200G로 설정해 얕은 소용돌이를 만들어 튀지 않게 하세요. 현탁액이 25도 섭씨에서 10분간 방해받지 않고 수분 공급되도록 두세요.

발효 직전에 통풍구 캡을 조이고, 플라스크를 손으로 다섯 번 돌려 혼합물을 부드럽게 균질화하고 침전된 물질을 다시 현탁시킵니다. 추가 카사바 제품 배지를 준비하려면 플라스크에 라벨을 붙이고 기질을 무게로 재면 작업 부피에 따라 리터당 30그램을 달성할 수 있습니다. 무균으로 무게를 측정한 기질을 무균 플라스크에 넣고, 그 플라스크에는 300밀리리터의 이온수 또는 증류수가 들어 있습니다.

각 플라스크에 통풍 캡을 다시 덮어주세요. 앞서 설명한 대로 서스펜션을 수분 공급하고 섞으세요. 플라스크에 멸균 가스 투과성 통풍 캡이 장착되어 있어 가스 교환을 허용하고 환경 오염을 최소화해야 합니다.

플라스크를 직사광선과 고유량 공기 흐름이 없는 지정된 장소에 25도 세워 놓고, 최소 72시간 이상 교란 없이 보관하세요. 각 플라스크의 발효 시작 날짜와 시간을 기록하고 상태를 기록하세요. 발효 후 각 500밀리리터 플라스크에 300밀리리터를 초과하지 않는 액체가 들어 있는지 확인하여 멸균 중 끓는 것을 방지하세요.

통풍 캡이 손가락으로 꽉 조일 정도로 풀리면, 플라스크에 오토클레이브 표시 테이프를 붙입니다. 플라스크를 오토클레이브 안전 트레이에 넣은 후, 트레이를 오토클레이브에 넣고 P13 액체 사이클을 선택합니다. 액체 살균을 위해 멸균 조건을 121도로 설정해 30분간 진행하세요.

오토클레이브 사이클을 시작하세요. 사이클이 끝나면 오토클레이브 챔버 압력이 대기압으로 돌아오도록 한 후 오토클레이브 문을 천천히 열어줍니다. 내열 장갑을 끼고 플라스크를 제거해 실온까지 식히세요.

접종 전에 냉각된 플라스크를 실온에서 하룻밤 보관하세요. 토종 미생물 군집을 보존하기 위해 오토클레이브 없이 발효된 카사바 매체를 직접 사용하세요. 비고용멸균 매체는 72시간 발효 후 즉시 접종하여 의도치 않은 환경 오염을 최소화하세요.

동일한 500밀리리터 통풍 캡 플라스크, 동일한 작업 부피, 동일한 발효 시간을 모든 기질 조건에서 사용하여 복제 간 일관된 취급을 유지합니다. Euglena gracilis를 신선한 이종영양 영양 배지에 접종하세요. 배양물을 28도 섭씨의 완전한 어둠 속에서 배양하며, 120G에서 지속적인 궤도 흔들면서 배양물이 중간 로그 성장 단계에 도달할 때까지 진행합니다.

복합 광각 현미경을 밝시야 모드로 사용하여 100배에서 400배 전체 배율로 배양물을 검사하여 활성 운동성, 길쭉한 세포 형태, 낮은 강도를 확인합니다. 적응 실험 전 과도한 세포 잔해, 이상 형태, 또는 높은 요구를 보이는 배양은 제외합니다. 통풍구 캡을 조여 스타터 배양물을 부드럽게 균질화한 후, 플라스크를 손으로 15초간 돌려 균일한 세포 분포를 유지하며 과도한 스트레스를 유발하지 않습니다.

노이바우어 혈구계를 사용해 세포 밀도를 측정합니다. 플라스크를 15초간 돌려 배양물을 혼합한 후, 1밀리리터 배양물을 멸균된 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 피펫으로 주입합니다. 혈구계와 커버 슬립을 70% 에탄올로 깨끗이 닦고, 헤모사이트미터와 커버를 자연 건조시키세요.

혈액세포계의 두 그리드에 10마이크로리터의 배양물을 피펫팅하고, 덮개를 젖은 샘플 위에 올려놓습니다. 10배 대물렌즈를 가진 밝방야 현미경을 사용하면, 격자에 초점을 맞추고 표준 경계 규칙을 적용하여 큰 격자 내 정사각형 집합 내 셀을 세는 것입니다. 두 번째 챔버에서 세포 수를 반복하고 밀리리터당 평균 세포 수와 세포 밀도를 계산합니다.

모든 실험 배지에서 부피별 5%의 최종 접종량을 얻도록 접종량을 조절합니다. 각 처리 조건별로 별도의 접종균을 준비하여 실험군 간 초기 세포 밀도를 일정하게 유지하세요. 준비된 E. gracilis를 최종 가리 농도인 10, 20, 30 g/리터에서 조제한 고용멸균 및 비고용멸균 카사바 매체에 첨가합니다.

초기 세포 밀도를 표준화하기 위해 모든 처리 조건에서 균등한 접종량을 사용하세요. 통풍 캡을 조인 후, 플라스크를 15초 동안 부드럽게 원을 그리며 돌려 세포를 분배시킵니다. 배양물을 25도 섭씨의 완전한 어둠 속에서 배양하여 이종영양 성장을 시작하세요.

비고용멸균 매체의 교란을 최소화하여 토착 미생물 군집 구조와 기질 층화를 보존합니다. 모든 배양물을 하루에 한 번씩 부드럽게 수동으로 휘저으며 15초간 섞어 E. gracilis 세포와 현탁된 카사바 재료 간의 접촉을 유지하세요. 멸균 피펫 팁을 사용해 48시간마다 각 배양액에서 1밀리리터 샘플을 무균으로 채취합니다.

통풍된 캡을 단단히 조이고 샘플링 전에 배양 플라스크를 15초간 부드럽게 돌려 세포와 부유 물질의 고르게 분포하도록 하세요. 배양액을 무균 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 옮긴 후, 개별 세포의 시각화를 개선하기 위해 필요에 따라 탈이온수로 샘플을 희석합니다. 희석된 샘플 10마이크로리터를 깨끗한 현미경 슬라이드에 피펫팅하고 커버 슬립으로 덮어 습식 마운트 현미경 슬라이드를 준비합니다.

복합 광각 현미경을 밝시야 모드로 사용하여 100배에서 400배 전체 배율로 샘플을 검사하고, 적응 상태를 나타내는 지표로서 세포의 운동성, 형태, 강제 빈도를 평가합니다. 7일마다 각 배양균의 부피 기준 20%를 동일한 가리 농도와 멸균 조건의 신선한 카사바 배지에 무균적으로 옮깁니다. 30그램/리터 카사바 배지에서 배양균이 일관된 성장, 지속적인 운동성, 낮은 요구율을 보일 때까지 통과 부양을 일정하게 유지하고 연속 전달을 반복하세요.

고농도 카사바 적응과 비교 성장 분석 후, 색도 띠를 사용해 시안화물 농도를 평가하고 발달한 색상을 관찰합니다. 원심분리 후에는 바이오매스를 수확하여 하류 분석을 수행합니다. 완전한 암흑 재배 조건에서, 가리 리터당 30그램으로 배양한 배양은 낮은 농도보다 더 높은 통합 성장을 보였다.

10에서 20그램/리터의 낮은 가리 농도는 검출 가능하지만 성장이 감소하고 변동성이 더 컸습니다. 리터당 40에서 50g의 높은 농도는 세포 밀도의 최고 수준을 높였으나, 안정화가 지연되고 변동성이 더 컸습니다. 트리판 블루 배제 검사 결과, 30그램/리터 가리로 유지된 배양은 샘플 시점에서 높은 생존력을 유지했습니다.

가리 농도가 높을수록 생존 가능성이 일시적으로 감소했다가 시간이 지남에 따라 변이가 증가하는 부분 회복이 나타났습니다. 양성 결과는 반복 하배양 과정에서 운동성이 감소한 둥근 또는 반강요 세포가 포함되었습니다. 적응한 E. gracilis 배양은 여러 기질 유형에서 재현 가능한 성장을 보였으며, 야생형 배양에 비해 후기 단계 감소가 감소하며 더 일찍 안정화되었습니다.

프로토콜의 성공적인 구현으로 외부 실험실 분석을 통해 연소 두마스법을 이용한 측정 가능한 원단백질 함량을 가진 E.gracilis의 생량이 확보되었습니다. 적응된 배양에서 관찰된 단백질 비율은 야생형 배양에서 측정된 것과 유사했으며, 전체 단백질 생산량이 증가함에 따라 바이오매스 축적이 증가했습니다. 이 프로토콜은 연구자들이 다양한 카사바 기반 환경에서 유글레나 성장, 시안화물 감소, 바이오매스 생산, 영양 잠재력을 연구할 수 있도록 합니다.

이 프로토콜의 핵심 과제는 유글레나 성장을 위한 안정적인 온도, 일관된 배양 조건, 균형 잡힌 미생물 군집을 유지하는 것입니다. 향후 연구들은 이 프로토콜을 최적화하고 확장하며, 단백질 수율을 개선하고, 다양한 카사바 폐기물을 대규모로 활용한 다양한 산업 응용 분야를 시험할 수 있습니다.