Name: 초파리 용해액에서 세포 없는 시험관 내 mRNA 번역 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 학습하세요 초파리 용해액을 이용한 세포 없는 시험관 내 mRNA 번역 방법을. Drosophila melanogaster 등 다양한 종에서 단백질 합성과 번역 조절 메커니즘을 연구할 수 있는 강력한 도구입니다.

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<table><tbody><tr><td>알루미늄 호일 시트</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td>표준 가정용 알루미늄 호일; 동등한 상업용 브랜드 허용.</td></tr><tr><td>아미노산 혼합물</td><td>Promega</td><td>L4461</td><td>N/A</td></tr><tr><td>애플 사이다 식초</td><td>Heinz</td><td>N/A</td><td>상업용 사과 사이다 식초(5% 산도); 동등한 브랜드 허용.</td></tr><tr><td>사과 또는 포도 주스</td><td>Jumex</td><td>N/A</td><td>상업용 포도 주스; 또는 동등한 상업용 브랜드.</td></tr><tr><td>박테리올로지컬 아가</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9002-18-0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>붕산(H3BO3)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td>BioReagent, 분자생물학 등급, &ge;99.5%, 분말; TBE 버퍼 준비에 사용.</td></tr><tr><td>캡: 역방향 캡(ARCA): 3'-O-Me-m7G(5'')ppp(5'')G RNA 캡 구조</td><td>BioLabs</td><td>S1411S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>캡: m7G(5'')ppp(5'')G RNA 캡 구조 아날로그</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>캡: 비기능성 캡 아날로그 G(5'')ppp(5'')A</td><td>New England Biolabs</td><td>S1406</td><td>N/A</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브(15mL)</td><td>Corning</td><td>430053</td><td>N/A</td></tr><tr><td>완전한, EDTA-프리 단백질분해효소 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>N/A</td></tr><tr><td>토끼 근육의 크레아틴 포스포키나제</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>C-3755</td><td>N/A</td></tr><tr><td>크레아틴 인산, 디나트륨 염</td><td>Merck</td><td>1120A47950</td><td>N/A</td></tr><tr><td>탈수 베이커 효모</td><td>Fleischmann's</td><td>N/A</td><td>상업용 활성 건조 효모; 동등한 브랜드 허용.</td></tr><tr><td>디에틸 피로카르보네이트</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>97%(NNR)</td></tr><tr><td>DNA 클린 & 콘센트레이터-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster 야생형 주 오레곤-R</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center, 미국 인디애나</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu/index.html ; Drosophila melanogaster의 돌연변이 주와 기타 Drosophila 종의 야생형 참조 주, 예를 들어 virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei 등은 이 Stock Center에서도 제공됩니다.</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>ACS 시약, 99.4-100.6%, 분말; TBE 버퍼 준비에 사용.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>SLBH4583V</td><td>99.5%(titration)</td></tr><tr><td>과산화수소(H2O2)</td><td>Equate</td><td>N/A</td><td>상업용(~2.5-3.5% 과산화수소 용액; 동등한 브랜드 허용.</td></tr><tr><td>인 비트로 전사 mMessage mMachine T7, T3, 또는 SP6 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1344 및 AM1348</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KOAc, 또한 KCH3COO라고도 함</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>여러</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Lb 브로스(lennox)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1kg</td></tr><tr><td>루시퍼라제 분석 시스템</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>N/A</td></tr><tr><td>MAXIscript T7, T3, 또는 SP6 인 비트로 전사 키트</td><td>Invitrogen</td><td>AM1316 및 AM1312</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mg(OAc)2, 또한 Mg(CH3COO)2라고도 함</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>여러</td><td>N/A</td></tr><tr><td>NaCl(나트륨 염화물)</td><td>J.T Baker</td><td>B17W53</td><td>ACS 시약</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드</td><td>어떤 회사</td><td>N/A</td><td>시퀀스 특이적.</td></tr><tr><td>Pasive lysis 5X 버퍼</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>파이펫 팁</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td>200 마이크로리터 노란색 팁.</td></tr><tr><td>파이펫 팁</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td>1ml 파란색 팁.</td></tr><tr><td>파이펫 팁</td><td>Axygen</td><td>T-300</td><td>0.5-10 마이크로리터 투명 팁.</td></tr><tr><td>프로피온산</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>79-09-04</td><td>ACS 시약 등급, &ge;99.5%, 액체.</td></tr><tr><td>PYREX® 5 mL 유리 페스틀 조직 그라인더</td><td>PYREX®</td><td>7724-5</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAprep spin 플라스미드 미니프레퍼 키트</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAquick 젤 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>N/A</td></tr><tr><td>토끼 소

초파리 용해액에서 세포 없는 시험관 내 mrna 번역

Cell-Free In Vitro mRNA Translation In Drosophila Lysates

초파리 용해액에서 세포 없는 시험관 내 mRNA 번역

Cell-free mRNA in vitro translation has played a crucial role in the understanding of the protein synthesis process during gene expression across ...

본 연구에서는 초파리 무세포 번역 시스템을 이용하여 곤충 발달의 다양한 단계에서 단백질 합성 및 번역 기전을 연구합니다. 이 프로토콜은 다른 후생동물의 용해물과 달리 곤충 발달에 특이적인 생체 내 번역 사건을 정확하게 재현합니다. 우선, Benchling 클로닝 소프트웨어를 실행하십시오.T7 프로모터 하위에 5' 비번역 지역, 반딧불이 루시퍼레이스(firefly luciferase) 또는 Fluc 리포터 시스트론, 3' 비번역 지역, 그리고 폴리아데닐레이트 또는 poly(A) 꼬리를 포함하는 작 constructs를 삽입하기에 적합한 플라스미드를 선택하십시오. 전사 전 각 플라스미드 작 constructs를 선형화하기 위해 poly(A) 꼬리 바로 하위에 있는 KPN1의 고유 제한 효소 부위를 사용하십시오. 인비트로(in vitro) 전사 템플릿으로 사용하기 전, 시퀀싱을 통해 얻은 작 constructs의 피크가 깨끗하고 명확하게 분해되었는지 확인하십시오.선형화된 DNA를 1% agaros 겔 전기영동을 이용하여 100V에서 1시간 동안 분리합니다. 선형화된 DNA를 겔 추출합니다. 이를 마이크로튜브에 넣고 DNA 정제를 위해 agaros 소화 버퍼 또는 ADB를 첨가합니다.튜브를 서모쉐이커(thermoshaker)에서 배양하십시오. 그 후 내용물을 컬럼으로 옮기고 원심분리하여 선형화된 DNA를 회수하십시오. 제조사의 지침에 따라 인비트로(in vitro) 전사 키트를 사용하여 선형화된 DNA를 전사하십시오.써모사이클러에 샘플을 넣고 적절한 프로그램을 선택합니다. 전사 후 DNA 템플릿을 제거하기 위해 모든 전사 반응물을 RNase-free DNase로 처리합니다. 제조사의 지침에 따라 염화리튬 침전법을 이용하여 전사물을 정제합니다.분광법을 사용하여 정제된 전사체를 정량하십시오. 1% agarose 겔 전기영동을 100V에서 1시간 동안 수행하여 messenger RNA 또는 mRNA의 무결성을 평가하십시오. mRNA를 소분하여 사용 전까지 -80°C에서 보관하십시오.대조군인 초파리(drosophila melanogaster) 야생형 계통 Oregon-R을 배양하기 위해, 길이가 약 1m이고 직경이 50cm이며 상단에 직경 약 30cm의 개구부가 있는 원통형 아크릴 케이지를 준비합니다. 상단 개구부를 덮을 수 있도록 메시를 배치하고 네 면을 테이프로 밀봉합니다. 초파리에 수분을 공급하기 위해 메시 위에 젖은

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여기 우리는 전체 마운트 형광을...

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우리는 여기에서 mRNA의 추출 및 정제를위한 절차와의 metabolites을...

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이 책의 목적은 시각화 및 초파리에서 추출한 RNA에 향상된 북부 얼룩 프로토콜의 동작 단계를 논의 배아, 세포 및 조직을 melanogaster하는 것입니다. 이 프로토콜은 작은 RNA 종의 효율적인 검출에 특히 유용하다.

작은 RNA 종의 북부 오 탐지의 향상된 초파리 Melanogaster

단백질 합성 조절은 주로 번역 시작 단계에서 발생하며, 결핍은 다양한 장애와 관련이 있습니다. 이들의 병인을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 여기에서 번역 시작 인자 eIF4G1의 돌연변이가 있는 상태에서 mos 전사체의 번역을 평가하는 Xenopus laevis 난모세포를 사용하는 프로토콜에 대해 설명했습니다.

Xenopus의 번역 손상을 식별 할 수있는 모델로 laevis의

Translating Ribosome Affinity Purification(TRAP)은 mRNA의 세포 유형별 번역을 캡처할 수 있습니다. 여기에서 우리는 초파리 배아의 희귀 세포 집단에서 mRNA를 분리하는 데 전념하는 최초의 TRAP 프로토콜을 보고합니다.

희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

이 프로토콜의 목표는 중형 규모 (0.5-1g)에서 초파리 ( Drosophila) 배아를 수집하고 친화도 정화 - 질량 분광 분석 (AP-MS)과 같은 하류의 단백질 응용 분야에서 사용할 수있는 단백질 추출물을 제조하는 간단하고 저렴한 접근법을 제공하는 것입니다 ).

중간 규모의<em&gt; Drosophila</em&gt; 프로테옴 실험을위한 배아 추출물

Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.

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이 문서에서는 RNA 표적 Cas13D 효소(RfxCas13D)를 파리에서 사용하기 위한 상세한 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

CRISPR/CasRx를 사용하여 드로소필라 멜라노가스터 에서 유비쿼터스 및 조직 별 RNA 표적화

이 논문은 초파리의 phiC31 인테그라제 매개 형질전환효소를 예로 들어 형질전환파리를 생성하기 위한 중요한 단계인 배아 미세주입에 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

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학습하세요 초파리 용해액을 이용한 세포 없는 시험관 내 mRNA 번역 방법을. Drosophila melanogaster 등 다양한 종에서 단백질 합성과 번역 조절 메커니즘을 연구할 수 있는 강력한 도구입니다.

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