카에노르랍디티스 엘레간스에서 생식계 특이 유전자의 CRISPR/Cas9 매개 내인성 형광 태깅

우리는 CRISPR 기반 내인성 태깅을 사용하여 C. elegans에서 생식세포 단백질의 위치와 동학을 연구합니다. 기존의 형질전환유전자는 생식세포 발현에 영향을 줄 수 있지만, 이 프로토콜은 내인성 유전자 좌의 단백질을 자연 조절 하에 태그합니다. 우선, 공개 데이터베이스와 출판된 문헌을 이용해 생식세포나 생식세포에서 우세한 발현을 가진 후보 유전자를 식별하세요.

목표 단백질의 UniProt 항목을 열면 구조를 클릭하여 구조적 특징과 단백질 도메인을 평가하고 적절한 형광 태깅 부위를 식별합니다. 아래로 스크롤하여 AlphaFold DB 항목을 열어 모델 신뢰 값을 확인하세요. 특정 구조 분류는 도메인을 클릭하세요.

다음으로, WormBase에서 목표 유전자 페이지를 엽니다. 아래로 스크롤하여 Sequences 위젯을 클릭하고 주요 성적 링크를 클릭하면 성적증명서 페이지를 열어보세요. 아래로 스크롤하여 '시퀀스' 섹션으로 가서 선택한 녹취록의 스플라이스 시퀀스를 보여주는 특정 옵션을 클릭하세요.

IDT CRISPA-Cas9 가이드 RNA 설계 도구 웹페이지에서 WormBase 페이지에서 목표 유전자의 첫 번째 엑손 서열을 복사해 붙여넣고, 가이드 RNA 또는 gRNA 설계를 위해 종 드롭다운 메뉴에서 C, elegans를 선택하세요. DESIGN 버튼을 클릭하여 권장 gRNA 서열과 해당 PAM 서열을 확인하고 검토할 수 있습니다. SnapGene에서 Sequence를 선택하여 CeU6 프로모터와 gRNA 스캐폴드 영역 사이의 클로닝 지점을 식별합니다.

IDT 도구 페이지에서 gRNA 서열을 복사하여 삽입 대화창에 붙여넣은 후 삽입을 클릭하여 스페이서를 CRISPR 발현 플라스미드에 통합하세요. gRNA 삽입의 정확도를 확인하려면 서열을 선택하고 '정렬 표시'를 클릭하여 Sanger 시퀀싱 결과를 염기별로 예상 서열과 비교하세요. 기증 플라스미드를 구성하려면 WormBase에서 상동 팔의 유전체 서열을 복사하세요.

SnapGene에서 시퀀스를 붙여넣고 삽입을 클릭하세요. 다음으로, 삽입 부위를 우클릭하여 Set DNA 색상 창을 열고 접합부를 표시하는 주황색으로 변경하세요. 녹색 형광 단백질 또는 GFP 삽입 서열을 복사하여 표시된 위치에 직접 붙여넣습니다.

그 다음 기능 추가를 클릭하세요. 기능을 GFP라고 명명하세요. 디스플레이 색상을 녹색으로 바꾸고 확인 버튼을 클릭하면 인실리코 기증자 플라스미드 조립을 완성합니다.

Cas9 통합 후 재절단을 방지하기 위해 기증 플라스미드 주형에 무언 치환을 도입하려면, 발현 벡터에서 19-뉴클레오타이드 gRNA 스페이서를 복사합니다. 기증 플라스미드 탭에서 DNA 서열 찾기 검색창에 서열을 붙여넣어 표적 부위를 찾고 돌연변이할 특정 뉴클레오타이드 위치를 선택하세요. 염기 교체에 새 뉴클레오타이드를 입력하고 삽입을 클릭하세요.

수정된 염기를 우클릭하고 Set DNA Color를 사용해 색을 빨간색으로 바꿉니다. 기증자 플라스미드 생거 시퀀싱 결과를 예상 서열과 정렬하여 무결성을 확인하세요. CRISPR 발현 플라스미드, 기증 플라스미드, 공동 주입 마커를 멸균 이중 증류수에 결합하여 표시된 농도의 최종 부피인 10마이크로리터로 주입 혼합물을 준비합니다.

그 후 혼합물을 10,000g에서 10분에서 20분간 원심분리하여 입자 물질을 제거하고 미세주입 모세관 막힘을 방지합니다. 바늘 풀러를 사용해 유리 모세혈관에서 길고 가늘고 날카로운 끝을 가진 미세 주사 바늘을 만들어 생식선 주입에 적합하며, 극성 설정을 경험적으로 최적화하세요. 미세모세관 피펫을 가열해 두 조각으로 나누어 로딩 도구를 만드세요.

단축된 미세모세관 피펫의 넓은 끝에 고무 흡입기 전구를 부착하세요. 약 1마이크로리터의 주입 혼합물을 로더에 흡입하세요. 로더를 주입 바늘의 뒷부분에 삽입하고 주사 혼합물을 부드럽게 분배합니다.

적재된 바늘을 10분간 수평으로 놓아 연속된 기둥을 만들고 용액이 끝 쪽으로 가라앉도록 합니다. 주입 현미경에 바늘을 장착하고 밝은 시야 광학으로 팁을 초점에 맞추세요. 바늘 끝을 할로카본 오일에 담근 커버 슬립 가장자리에 부드럽게 닿아 열어 흐름을 확인하세요.

주사용 벌레를 배양하려면, N2 야생형 벌레를 OP50 박테리아 씨앗 배지 플레이트에 유지하세요. 건강한 배지에서 L4 단계의 자웅동체를 선별하여 20도 섭씨에서 10시간 배양하여 잘 발달한 생식계통을 가진 젊은 성체를 얻습니다. 박테리아 잔류를 줄이기 위해 씨앗이 없는 판에 벌레를 옮기세요.

유리 슬라이드에 마른 2%아가로스 패드를 준비하세요. 그리고 할로카본 오일 한 방울을 발라. 속눈썹 피집기를 사용해 벌레를 아가로스 패드 위에 옮기고 움직이지 못하게 하세요.

저배율 대물렌즈를 사용해 생식선을 주입할 방향을 잡으세요. 마이크로매니퓰레이터 컨트롤을 사용해 바늘을 웜에 대해 20도에서 40도 각도로 위치시키세요. 고확대 렌즈로 원위 생식계 세포에 초점을 맞추세요.

벌레를 바늘 위로 밀어 넣고 끝을 생식선 융합 안에 위치시킵니다. 용액을 주입해 생식선이 부풀 때까지 계속하세요. 바늘을 빼고 다음 주사를 위해 위치를 재조정하세요.

M9 버퍼를 추가해 아가로스 패드를 부드럽고 부분적으로 부수어 벌레를 방출하세요. 각 웜을 개별 회수 플레이트로 옮기세요. 그 후 20에서 25마리의 벌레에게 주사를 반복하세요.

F1 자손을 선별하여 공동 주입 마커를 검사하고 마커 양성 동물을 선택합니다. 각 F1 벌레를 개별 판에 옮기고 산란을 위해 1일에서 이틀을 두세요. 각 F1 벌레를 단백질효소 K 버퍼에 용해하여 PCR 템플릿을 준비합니다.

상동암 외부에 유전체 프라이머 하나와 내부 태그 프라이머 하나를 사용해 접합 PCR을 수행합니다. 그리고 PCR 양성 F1 동물의 해당 플레이트를 보관합니다. PCR 양성 F1 계통에서 F2 자손을 개별 판에 분리하여 자손을 생산합니다.

유전자 분류를 위해 성체 용해체. 상동암 양옆에 프라이머를 배치하여 산물 크기에 따라 야생형 및 노크인 대립유전자를 구별하는 PCR을 수행합니다. SnapGene 도구를 사용하여 왼쪽과 오른쪽 삽입 접합부 모두에서 Sanger 시퀀싱 결과를 예상 편집된 유전체 서열과 일치시켜 올바른 통합을 검증하고 검증합니다.

형광 현미경을 사용해 생식세포 발현과 위치를 확인하세요. 확인된 동형접합 계통을 확장하세요. 재고를 유지하고 검증된 라인을 냉동 보존하여 장기 보관을 하세요.

F1 자손에 대한 PCR 기반 스크리닝 결과, 1,550염기쌍 접합 PCR 증폭체를 한 개의 측면 유전체 및 한 개의 내부 GFP 프라이머를 사용하여 성공적인 노크인이 확인되었습니다. 대부분의 F1 동물에서 1,550염기쌍 밴드가 없다는 것은 상동 지향 수리보다는 비통합 DNA 전달과 일치하는 표적 통합이 없음을 시사합니다. 접합 PCR 양성 계통에서 유도된 F2 자손의 접합성 결정은 1,345염기쌍의 밴드 크기로 대립유전자를 야생형 대립유전자로, 2,344염기쌍을 노크인 대립유전자로 구별합니다.

헤테로접합체는 두 밴드를 모두 보여줍니다. 동형접합 녹인 샘플은 야생형 크기 밴드가 없으며, 통합 실패 샘플은 야생형 크기의 생성물만 보인다. 동형접합 GFP 녹인 라인에 대한 추가 검증은 공초점 현미경 영상을 사용해 생식세포에서 GFP 형광을 관찰했으며, 정자 생성 영역에서 신호가 풍부해졌습니다.

이 프로토콜은 C. elegans 생식계통에서 단백질 위치 및 역학을 생체 내에서 분석할 수 있게 합니다. 단백질 기능을 보존하고 위양성 후보를 최소화하기 위해서는 신중한 태그 설계와 철저한 검증이 필수적입니다. 향후 연구에서는 이 워크플로우를 활용해 단백질 위치 추적과 생식계 발달 중 잠재적 상호작용을 탐구할 수 있습니다.