애기장대 핵에서 단일 분자 위치 현미경을 위한 간소화된 프로토콜
May 8th, 2026
이 프로토콜은 최적화된 분리, 고정, 표지를 활용하여 분리된 애기장대 핵의 단일 분자 위치 현미경 영상을 효율적으로 수행하여 크로마틴과 RNA 중합효소 II의 신뢰성 있는 나노 규모 시각화를 달성합니다. 이 접근법은 고해상도 영상을 위한 다른 염색질 관련 단백질이나 히스톤 변형에도 쉽게 적용할 수 있습니다.
저의 연구는 초해상도 현미경을 이용한 후생유전체 편집과 애기장대 핵의 염색질 조직 시각화에 중점을 두고 있습니다. 기존 방법들은 STORM 이미징에 적합하지 않습니다. 이 프로토콜은 핵 순도, 표지 일관성, 시료 마운팅 및 영상 안정성을 향상시킵니다.
이 연구는 고해상도로 핵 조직, 염색질 구조, 후생유전학을 연구하기 위해 Arabidopsis thaliana 및 기타 식물 시스템에 적용됩니다. 먼저, 6웰 배양판을 연기 후드 아래에 얼음 위에 올려놓으세요. 부피 기준 4%, 메탄올 안정화 포름알데히드 0.1%, Triton X100, PBS를 포함한 고정액을 혼합합니다.
훈풍 후드 아래 각 웰에 약 4밀리리터의 얼음 냉각 고정액을 추가하세요. 깨끗한 겸자를 사용해 발아 후 8일에서 15일 사이에 생긴 애기장대 묘목을 단단한 반 강도 무라시게와 스쿠그, 즉 MS 배양지에서 제거하세요. 즉시 묘목을 고정 용액에 담그고 우물당 약 20개의 묘목을 심으세요.
샘플당 충분한 물질을 얻기 위해 세 개의 우물을 사용하세요. 접시를 얼음으로 채운 진공 챔버에 넣고 닫으세요. 마이너스 0.6바에서 마이너스 0.8바 사이에서 진공 사이클링을 15분간 적용하여 갇힌 공기를 제거하고 고정제가 식물 조직에 깊숙이 침투할 수 있도록 합니다.
그 다음 천천히 진공을 해제하세요. 샘플을 섞고 진공청소기를 15분 더 적용하세요. 훈제 후드 아래에서 피펫으로 고정액을 제거하세요.
각 웰을 3번, 각각 10분씩 5밀리리터의 얼음 차가운 PBS를 사용해 부드럽게 저어줍니다. 세척 후에는 PBS를 제거하세요. 겸자를 사용해 고정 조직을 120 x 120밀리미터 크기의 페트리 접시로 옮기고, 고정된 묘목에 핵 분리 완충제를 50마이크로리터 첨가합니다.
칼날로 고정된 조직을 잘라내세요. 같은 칼날로 다진 조직을 페트리 접시 한쪽 가장자리에 긁어내세요. 핵 분리 완충제 600마이크로리터를 추가하고 칼날에 붙은 조직을 씻어내세요.
조직 슬러리를 2밀리리터 Dounce 균질제로 옮기고, 작은 공으로 5번에서 10번 정도 스트로크합니다. 그 후 큰 공으로 튜브 안에서 부드럽게 움직일 때까지 쓰다듬으며, 보통 5번에서 10번의 스트로크가 필요합니다. 균질화된 샘플을 30마이크로미터 메시 필터를 통해 50밀리리터 튜브에 필터링합니다.
여과액을 신선한 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 서스펜션을 800G에서 10분간 원심분리하여 가속과 감속을 위해 가장 낮은 경사로를 사용하세요. 원심분리 후에는 녹색 조직 잔해 사이에 작은 흰색 펠릿이 보입니다.
상청액을 버리고 600마이크로리터의 핵 분리 완충제에 펠릿을 다시 부탁합니다. 800G에서 다시 10분간 원심분리한 후 상환액을 제거하세요. 녹색 이물질을 완전히 씻어낸 후, 분리된 핵 현탁액을 최대 일주일간 4도 섭씨 온도에서 보관하고, 원하는 항체로 핵을 면역염색합니다.
1.5% 무게의 저융 아가로스 용액을 90도 섭씨에서 1분간 가열하여 분말을 녹이고 투명한 용액을 얻습니다. 완전한 혼합을 위해 잠시 보텍스를 사용하세요. 용액을 식히고 37도 섭씨로 유지한 후 포도당 산화효소 완충제의 열 변성을 방지하세요.
저융 아가로스 용액이 37도에 도달하면, 100밀리몰라 머카토에틸아민과 포도당 산화효소 완충제를 저융도 아가로스에 첨가하여 최종 농도의 1배를 얻고 부드럽게 혼합하여 STORM 버퍼를 준비합니다. 핵 혼합물 10마이크로리터를 오존 처리된 1.5H 덮개 슬립에 증착하고, 이 슬립은 자외선 오존 세척 시스템에서 20분간 처리됩니다. 핵이 덮개 슬립에 침착할 때까지 3분간 기다립니다.
그 후 남은 액체를 제거하고 2분간 기다리세요. 덮개 슬립에 준비된 저녹도의 아가로스 10마이크로리터를 넣고 즉시 현미경 슬라이드로 덮습니다. 커버 슬립은 실리콘 실란트로 밀봉하세요.
마이크로피펫 팁을 사용해 작은 페트리 접시에서 용액 A와 용액 B를 같은 양으로 혼합합니다. 커버 슬립 가장자리에 혼합물을 바르면 샘플을 밀봉합니다. 실리콘 실란트를 5분간 굳히세요.
샘플 슬라이드를 현미경에 장착하고 초점을 찾으세요. 핵을 찾아 집중하세요. 장기 획득 시 안정성을 보장하기 위해 초점 유지 모듈이 가능하다면 활성화하세요.
재구성 과정에서 드리프트 보정을 개선하기 위해 하나 또는 몇 개의 나노다이아몬드가 핵 근처에 위치하는 영역을 선택하세요. 2색 이미징의 경우, 먼저 더 긴 파장 채널로 획득한 후 짧은 파장 채널로 전환하여 완전한 이미징을 수행합니다. ThunderSTORM에서 가우시안 피팅과 가중 최소제곱 추정을 사용하여 원시 이미지 스택을 처리하고 재구성된 이미지를 생성합니다.
30나노미터 이하의 시그마와 불확실성을 기반으로 필터링하여 정확한 위치 측정과 노이즈를 제거하세요. 마지막으로, ThunderSTORM 교차상관법이나 COMET 알고리즘을 사용하여 샘플 드리프트 보정을 수행하여 재구성된 이미지에서 최소 드리프트를 확인합니다. 핵은 15일 된 야생형 묘목에서 AF647 접합 2차 항체로 면역표지하고 Hoechst H33258로 염색한 후 분리되었습니다.
공초점 영상에서는 색중심과 핵소체가 명확히 구별되는 최소한의 이물질 상태에서 분리되고 잘 보존된 여러 핵이 확인되었습니다. RNA 중합효소 II 신호는 염색심과 핵소체에서 결여되었다. 회절 제한 최대 강도 투영과 이에 대응하는 SMLM 재구성은 RNA 중합효소 II와 DNA 표지의 구조적 세부사항을 밝혀냈으며, 관심 영역이 확대되어 더 미세한 구조를 보여준다.
시그마와 불확실성 기반의 위치 필터링은 RNA 중합효소 II와 DNA 신호의 정의를 검출된 위치 분석에 비해 개선했습니다. 그리고 드리프트 보정 이후의 추가 개선으로 이 개선된 구조가 유지되었습니다. 시그마 값 기반 필터링은 과도하게 작거나 큰 맞춤 폭을 가진 위치 지정을 제거했습니다.
푸리에 링 상관 분석 결과, 필터링 후 AF647 채널의 해상도는 90.1나노미터에서 47.7나노미터로, JF549 채널은 56.6나노미터에서 27.9나노미터로 향상되었습니다. 핵 무결성을 유지하면서 잔해와 배경 형광을 최소화하는 것은 고품질 단일 분자 이미징을 달성하는 데 매우 중요합니다. 향후 연구는 핵 구조를 환경 또는 발생 조건 하에서 유전자 조절과 연결할 수 있을 것입니다.
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Overview
This article introduces a streamlined and reproducible protocol for Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM), specifically direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), to visualize chromatin architecture in nuclei isolated from Arabidopsis thaliana. The workflow addresses technical challenges in plant sample preparation, enabling nanoscale imaging of chromatin domains, histone modifications, and nuclear organization with enhanced clarity and reproducibility.
Key Study Components
Area of Science
- Plant cell biology
- Super-resolution microscopy
- Chromatin organization
Background
- Confocal fluorescence microscopy is limited by diffraction, restricting resolution in chromatin studies.
- Super-resolution techniques like SMLM overcome these limitations, providing nanoscale insights.
- dSTORM is widely used in mammalian systems but less so in plants due to sample preparation challenges.
- Improved protocols are needed to facilitate SMLM in plant nuclei.
Purpose of Study
- To develop a reproducible workflow for SMLM imaging of plant nuclei.
- To enable high-resolution visualization of chromatin modifications and nuclear architecture in Arabidopsis thaliana.
- To lower technical barriers for applying super-resolution microscopy in plant biology.
Methods Used
- Fixation of Arabidopsis seedlings to preserve nuclear morphology.
- Gentle tissue chopping and centrifugation to enrich for intact nuclei.
- Fluorophore labeling of isolated nuclei in liquid medium.
- Immobilization of nuclei on low-melting agarose pads for imaging stability.
Main Results
- The protocol minimizes background fluorescence and improves labeling consistency.
- Enhanced reproducibility is achieved across biological replicates.
- Preparations allow clear visualization of chromatin modifications and nuclear architecture at the nanoscale.
- The workflow facilitates studies of epigenetic regulation and nuclear topology in plants.
Conclusions
- This protocol establishes a methodological foundation for SMLM imaging in plant systems.
- It bridges the gap between plant and mammalian cell biology in super-resolution imaging.
- The approach opens new opportunities to study genome regulation and nuclear architecture in response to developmental and environmental cues in plants.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Super-resolution imaging of chromatin architecture in plant nuclei addresses a critical gap in understanding epigenetic regulation and nuclear organization at the nanoscale. This streamlined SMLM protocol for Arabidopsis nuclei enables reproducible, high-resolution visualization, supporting predictive confidence in chromatin state analysis. The approach enhances early discovery and mechanistic de-risking for plant-based R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables nanoscale interrogation of chromatin domains and histone modifications in plant nuclei.
- Supports functional validation of epigenetic targets by visualizing nuclear architecture changes.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct observation of chromatin organization.
- Improves predictive confidence in linking nuclear structure to gene regulation.
Screening & Assay Development
- Provides standardized sample preparation for reproducible super-resolution imaging workflows.
- Delivers quantitative, high-clarity readouts of chromatin modifications for assay development.
- Enables consistent labeling and imaging across biological replicates, supporting screening scalability.
- Prepares validated plant nuclear systems for downstream compound or genetic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin imaging outputs with translational biomarker discovery in plant systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of epigenetic interventions.
- Enables risk-adjusted advancement by clarifying nuclear topological changes under different conditions.
- Provides mechanistic insights relevant to environmental and developmental response studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early chromatin hypothesis testing to preclinical validation of epigenetic mechanisms in plants.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of chromatin organization and nuclear architecture.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables precise measurement of chromatin modifications and nuclear features for comparative studies.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by enabling biomarker alignment in plant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging workflow adaptable to diverse plant research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in chromatin state analysis.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and imaging, enhancing reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for epigenetic target programs in plant R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of plant-based discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy and plant nuclear isolation.
- Needs access to dSTORM-capable imaging platforms and fluorophore labeling reagents.
- Demands cross-team standardization of fixation, labeling, and immobilization protocols.
- May require adaptation for different plant species or tissue types.
- Sample stability and background minimization are critical for reproducible outputs.
