암컷 마우스 요도 상피를 단일 세포 및 면역형광 분석을 위한 최적화된 방법

우리 그룹은 비뇨생식기의 상피 패턴 연구에 관심이 있습니다. 이 프로토콜은 암컷 쥐 요도의 상피 내막을 분리하여 분자 및 세포 분석을 위한 최적화된 방법입니다. 이 논문에서 설명한 방법들은 여성 요도 점막과 면역 방어에서의 역할에 대한 연구에 도움이 될 것입니다.

우선, 안락사된 암컷 CD1 생후 6주에서 12주 된 쥐를 해부 테이블 위에 누운 자세로 눕히세요. 복부에 70% 에탄올을 뿌려 머리를 적셔주세요. 겸자를 사용해 복부 피부를 들어 올립니다.

그 다음 작은 가위로 하체 쪽으로 수직 절개를 하여 외부 요도 입구에서 끝납니다. 방광을 확인하고 겸자로 부드럽게 들어 올려 비어 있고 소변이 없는지 확인하세요. 가위를 사용해 방광 주변의 지방과 결합 조직을 다듬어 치골 결합부에서 두 치골이 만나는 나비 모양 구조를 드러냅니다.

치골 결합 아래를 지나는 요도를 관찰하세요. 그 다음 겸자로 치골 결합을 들어 올리고 가위로 잘라내세요. 치골 조각을 제거하여 질벽 복측면에 놓인 얇은 요도를 노출시킵니다.

가는 겸자를 사용해 방광을 부드럽게 몸 안에서 위로 당겨 올립니다. 요도와 질 벽 사이에 가위를 넣어 요로와 생식기를 분리하세요. 요도 뒤쪽을 따라 절개하면서 방광에 약간의 긴장을 유지해 질 벽과 분리하세요.

원위 요도 입구까지 계속 절단하면 전체 길이의 쥐 요도를 얻으며, 길이는 1.2센티미터에서 1.5센티미터입니다. 다음으로, 방광 목부분에 한 개의 절개를 하여 요도를 방광과 분리합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 신선한 HBSS가 들어있는 멸균 페트리 접시에 네 개에서 다섯 개의 요도를 모으세요.

해부 현미경 아래에서 요도 주변 지방과 결합 조직을 미세한 집자와 가위로 다듬으세요. 그 다음 가위로 요도를 가로로 두 개의 같은 크기의 조각으로 자릅니다. 휴지 조각을 100마이크론 나일론 메쉬 체기 위에 올려놓으세요.

조직 조각을 1밀리리터 HBSS로 세척한 후, 1밀리리터 1% 트립신이 HBSS에서 조제된 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 항생제 및 항흡혈제를 첨가하여 옮깁니다. 다음으로, 샘플을 분당 30회전, 섭씨 4도의 회전 속도로 15분에서 30분 동안 배양합니다. 소화 후에는 HBSS에서 준비한 10밀리몰라 염화마그네슘을 튜브에 추가하고, 이어서 PBS로 조제한 DNAse I 10마이크로그램/밀리리터를 투여합니다.

튜브를 37도 섭씨 하이브리드화 오븐 안에 놓은 회전 장치에서 15분에서 30분간 부양시킵니다. 트립신을 소집하기 위해, 요도 조직을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 실온에서 10% 양 혈청이 담긴 HBSS에 옮깁니다. 5분 후, 요도 조직을 얼음 차가운 HBSS가 들어있는 새로운 관으로 옮기고, 이어서 멸균된 피트리 접시에 얼음 차가운 HBSS를 넣습니다.

샘플을 현미경으로 관찰할 때, 요도 조각의 한쪽 끝을 겸자로 잡으세요. 또 다른 겸자를 사용해 요도 조각 전체를 따라 통과시켜 투명한 상피 시트를 압출합니다. 분리된 요도 상피 시트 일부를 직접 처리하여 전체 마운트 면역염색을 하여 상피세포와 상피 관련 대식세포를 현장에서 시각화합니다.

작은 플라스틱 피펫을 사용해 네다섯 개의 모인 쥐 요도에서 분리한 HBSS 방울 내 상피 조각을 멸균 페트리 접시로 옮깁니다. 가위를 사용해 상피를 작은 조각으로 잘게 썰어주세요. 다진 상피 조각을 37도에서 1.5밀리리터의 예열된 아큐타제 소화액이 담긴 2밀리리터 마이크로 원심분리관에 옮깁니다.

샘플을 37도에서 회전기에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후에는 전체 내용을 칼슘 및 마그네슘 프리 1X PBS와 1% BSA로 구성된 워시 버퍼 2밀리리터가 들어 있는 5밀리리터 원심분리관에 옮깁니다. 스윙하는 버킷 로터를 사용해 600G에서 4도 섭씨에서 5분간 원심분리합니다.

다음으로, 부드러운 진공청소기로 상액을 흡인합니다. 그 다음 1밀리리터 필터 팁 피펫을 사용해 펠릿을 1밀리리터 세척 완충제에 다시 부유합니다. 펠릿을 위아래로 피펫팅해 덩어리가 작아질 때까지 부숴버립니다.

서스펜션을 23.5게이지와 26.5게이지 바늘을 통과시키고, 각각 1밀리리터 주사기에 4개의 스트로크를 사용해 연결됩니다. 다음으로, 5밀리리터 튜브 위에 놓인 30마이크론 프리셀레이션 필터 표면을 적시기 위해 1밀리리터의 워시 버퍼를 추가합니다. 26.5게이지 바늘에 연결된 주사기를 사용해 셀 현탁액의 1밀리리터를 필터를 통과시킵니다.

그 다음 1밀리리터의 워시 버퍼로 튜브를 세척한 후 필터를 통과시킵니다. 셀을 600G에서 4도에서 5분간 원심분리하여 스윙하는 버킷 로터를 사용해 펠릿으로 세포를 만듭니다. 상정액을 흡인하세요.

펠릿을 100마이크로리터의 세척 완충제에 재현탁하고, 적혈구 용해 완충액 100마이크로리터를 추가하세요. 정확히 3분 후에 세척 버퍼 4밀리리터를 넣고 섞습니다. 스윙 버킷 로터를 사용해 600G에서 4도 섭씨에서 5분간 원심분리하여 세포를 수확합니다.

펠릿을 재현탁하기 전에 펠릿 크기에 따라 50에서 200마이크로리터의 세척 버퍼에 상청액을 제거하세요. 5마이크로리터 알리코트 세포와 5마이크로리터 트리판 블루를 혼합한 후 혈액세포계에 적재하여 세포 수율과 생존 가능성을 평가합니다. 유세포분석을 이용해 세포 생존 가능성을 평가하고 서로 다른 세포 집단을 정량화합니다.

요도 상피 단세포를 기저막 기질 내에서 배양하고 오가노이드 확장 배지를 통해 3차원 요도 상피 오가노이드를 생성합니다. 내장된 오가노이드 절편에 헤마톡실린 에오신 염색과 형광 면역염색을 수행하여 오가노이드 구조와 세포 구성을 시각화합니다. 분리된 요도 상피 피는 분리 후 기질 조직보다 투명도가 높았다.

상피 피집의 전면 면역염색 검사에서 E-cadherin CDH1 항체로 강한 표지가 관찰되었습니다. F480 항체를 표지한 결과, 대식세포가 요도 상피세포 사이에 가지형 수상돌기 구조를 형성하는 것이 확인되었습니다. 요도 상피에서 분리된 단일 세포는 아민 반응성 Ghost Dye V 450을 사용한 혈구세포계와 유세포검사에서 트라이판 블루 배제를 통해 일관되게 높은 생존성을 보였습니다.

분리된 세포들은 살아있는 세포에 게이팅된 후 상피세포 집단이 풍부해졌습니다. CD45 양성 면역세포의 약 1.3%와 대식세포 1.18%가 단일 세포 현탁에서 관찰되었습니다. 요도에서 분리된 단일 상피세포는 생존 가능했으며, 3차원 기질 내에서 오가노이드 형성을 이루었으며, 배양 중 6일째까지 오가노이드 성장이 관찰되었습니다.

헤마톡실린 이오신 염색은 요도 상피 오가노이드의 두 가지 뚜렷한 형태를 보여주었는데, 여기에는 큰 속이 빈 오가노이드와 작은 고체 오가노이드가 포함됩니다. 속이 빈 요도 상피 오가노이드 모두 층화되어 기저층에서 KRT5와 P63을 발현하였다. 이들은 기저 세포 층과 중간 세포층에서 KRT-13을 발현시켰습니다.

근위 요도에서 생성된 오가노이드는 속이 빈 오가노이드의 비율이 더 높았고, 원위 요도에서 생성된 오가노이드는 더 고체 구체를 형성했다. 이 프로토콜은 연구자들이 근위 및 원위 요도에서 상피세포의 요도 세포 유형과 자가 재생 능력을 연구할 수 있게 합니다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 고려사항 중 하나는 전체 요도를 신중하게 해부하고 최적의 효소 소화를 통해 생존 가능한 요도 상피 세포를 얻어 후속 분석을 수행하는 것입니다.

이 프로토콜로 생성된 상피세포는 단일 세포 RNA 시퀀싱, 대량 RNA 시퀀싱, 유동 세포분석, 면역염색, 오가노이드 배양 등 다양한 응용 분야에 사용될 수 있습니다.