림프와 혈관 동시 샘플링을 통한 간 수송 경로를 평가하는 포괄적인 쥐 모델

우리 연구실은 염증성 및 심장대사 질환에서 림프계의 역할을 연구하고, 이러한 질환을 치료하기 위해 림프계를 표적으로 하는 약물 전달 전략을 개발합니다. 이 프로토콜은 다양한 조건에서 약물 대사, 영양소 흐름, 면역 신호 전달, 간 반응 등 간 과정을 평가할 수 있게 합니다. 우선, 약 250-300그램의 마취된 수컷 스프래그-도울리 쥐를 경동맥과 경정맥을 통해 성공적으로 배쪽 누운 자세에 관해 관을 삽입한 상태에서 수술용 현미경 아래에 놓습니다.

갈비뼈 아래 약 1.5-2센티미터 지점, 중앙선에서 오른쪽 옆구리까지 4-5센티미터 수평 피부 절개를 합니다. 피부를 당기고 외복사근과 내복사근에 일치하는 절개를 하세요. 시술 중 만나는 큰 혈관은 지져서 결찰하세요.

식염수에 젖은 면봉을 사용해 간을 횡격막 쪽으로, 위는 왼쪽으로, 소장은 아래쪽으로 이동시킵니다. 장기는 식염수에 적신 거즈로 수축시키세요. 간동맥과 평행하고 약간 꼬리쪽에 위치한 간림프관을 확인하며, 오른쪽 신장 내측에 위치하며 하대정맥과 인접해 있습니다.

더 크고 불투명하거나 흰색인 장간간막 림프관을 해부학적 기준으로 사용하여 후리에 위치한 반투명하고 좁은 간 림프관을 식별합니다. 림프관과 대정맥 위에 덮인 결합 조직을 제거하기 위해 그라페 겸자를 사용하세요. 겸자를 오른쪽 신장 아래의 지방층을 통해 삽입하여 대정맥 아래에 터널을 만듭니다.

겸자를 앞으로 밀어 끝이 대정맥 반대편 간림프관과 평행하게 나오도록 합니다. 겸자를 사용해 미리 준비된 캐뉼라의 외부 끝을 잡고, 캐뉼라를 터널 안으로 당겨 끝이 반대편으로 나오도록 합니다. Halsted 모기 제혈기 겸자를 사용해 25게이지 바늘 끝을 약 90도로 구부리세요.

구부린 바늘을 사용해 수술자와 가장 가까운 오른쪽 간림프관을 조심스럽게 찔러 주세요. 카뉼라에 항응고제 용액이 미리 채워져 있는지 확인하고, 공기 방울이 있다면 제거하세요. 경사된 끝을 약 2밀리미터 정도 덕트 안에 삽입하세요.

캐뉼라 외부 끝에서 약 100마이크로리터/시간의 림프 흐름을 확인하세요. 혈류가 관찰되지 않으면 캐뉼라를 조정하거나 다시 삽입하세요. 캐뉼라를 수집 쪽에서 막고, 삽입 부위를 고정하기 위해 수의학용 접착제를 소량 발라주세요.

접착제가 마르면 튜브를 통해 림프가 흐르는지 확인하세요. 그 후 거즈를 제거하고 장기를 원래 위치로 돌려놓으세요. 항응고제 용액이 담긴 채취관을 캐뉼라 출구 아래에 놓고 림프가 관으로 낙하 방향으로 흐르는지 확인합니다.

그 후 복벽을 내복사근, 외복사근, 피부층을 차례로 봉합합니다. 간림프 캐논레이션 직후에는 경정맥 캐뉼라를 통해 시간당 1.5-3.0밀리리터의 멸균 생리식염수를 주입하여 수분 보급을 시작하세요. 호흡과 반사 신경을 모니터링하면서 마취를 유지하세요.

경정맥 캐뉼라를 통한 치료 투여 후, 간 림프를 항응고제 용액이 담긴 관에 지속적으로 수집합니다. 수집관은 매시간 또는 필요에 따라 교체하세요. 말기 샘플링 전에 추정 순환 혈액량의 10% 이하로 유지하되, 지정된 시점에 경동맥 혈액 샘플을 채취하세요.

복부 절개를 다시 열어 상복부를 노출시키고, 깊은 마취와 안정적인 호흡을 유지하세요. 식염수 촉촉한 거즈를 사용해 간을 부드럽게 횡격막 쪽으로, 위는 왼쪽으로, 소장은 아래쪽으로 당기세요. 간간막 림프관 인접에 위치한 간림프관과 평행하게 뻗은 간동맥을 확인하세요.

외경 0.61mm, 내경 0.28mm의 폴리비닐 캐뉼라를 구하고, 항응고제 용액으로 미리 채워 공기 방울을 제거합니다. 곡선형 홍채 겸자를 사용해 간동맥의 짧은 구간을 분리합니다. 동맥 아래에 4-0 실크 봉합사를 넣으세요.

동맥을 부드럽게 들어 올리고 첫 번째 봉합사 원위에도 두 번째 봉합사를 삽입하세요. 원위 봉합선은 역류를 조절하기 위해 묶고, 근위 봉합선은 나중에 닫을 수 있도록 묶지 않은 채로 두세요. 미세 가위를 사용해 봉합사 사이 동맥벽에 약 0.5밀리미터 정도의 작은 횡절개를 합니다.

듀몽 겸자 끝을 사용해 혈관 플랩을 들어 올려 캐뉼라 삽입을 위해 혈관 내강을 안정화하세요. 폴리비닐 캐뉼라의 경사진 끝을 입구에 삽입하고 캐뉼라를 약 2-3밀리미터 앞으로 밀어주세요. 혈관과 캐뉼라 모두에 근위 봉합선을 묶어 캐뉼라를 고정하세요.

밝은 빨간색 동맥혈을 소량 흡인하여 올바른 위치를 확인하세요. 0.5-1밀리리터의 혈액을 항응고제가 포함된 사전 라벨 튜브에 채취하세요. 흉부, 간, 장간막 림프에서 정맥 주사 투여된 고분자 치료제의 림프 회복은 림프 수송 평가에 이 모델의 유용성을 입증합니다.

간 림프는 흉부 및 장간막 림프보다 총 지질 함량이 현저히 낮지만, 단백질 농도는 다른 림프원과 비슷합니다. 이 프로토콜은 간림프와 혈액을 동시에 측정하여 약물, 영양소, 신호 등 분자의 운반, 대사 및 제거를 평가할 수 있게 합니다. 간림프관의 정밀 삽입은 기술적으로 어렵고 신중한 해부학적 식별과 수술 기술이 필요합니다.

향후 연구에서는 이 기술을 이용해 간 수송, 정리 및 대사를 지도화하여 간 질환 이해와 표적 치료법 개발에 기여할 수 있습니다.