광혈전성 뇌졸중 모델링과 행동하는 쥐의 신경 및 성상세포 활동의 생체 내 옵트로드 기록을 위한 통합 방법

본 연구에서는 행동 중인 마우스의 허혈성 뇌졸중 동안 성상교세포와 뉴런의 활동을 동시에 기록하는 통합 방법을 개발했습니다. 기존 방법들은 뉴런 또는 성상교세포를 개별적으로 기록했습니다. 본 프로토콜은 뇌졸중 발생 순간부터 성상교세포와 뉴런의 신호를 동시에 포착합니다.

먼저, 깊게 마취된 C57BL/6J 마우스를 마취 마스크가 장착된 정위 고정 틀(stereotaxic frame)로 옮깁니다. 피드백 제어 가열 패드로 마우스의 체온을 36~37.5 °C로 유지하면서 10분마다 마취 깊이를 모니터링합니다. 눈에 안연고를 바른 후, 이어 바(ear bars)와 마우스 바(mouth bar)를 사용하여 마우스를 정위 고정 틀에 고정합니다.

머리가 대칭적으로 고정되면 가볍게 확인하여 머리 고정 상태를 점검합니다. 제모 및 피부 무균 처리를 마친 후, 수술용 가위로 중앙 절개를 실시합니다. 생리식염수와 면봉으로 골막을 닦아내어 bregma와 lambda를 노출시킵니다.

유리 마이크로피펫을 내려 Bregma와 Lambda에 순차적으로 접촉시킵니다. 디지털 버니어 캘리퍼스에서 Z 좌표를 확인한 후, 두 지점의 차이가 0.04 mm 미만이 될 때까지 마우스 바(mouth bar)를 조절합니다. 유리 마이크로피펫을 내려 Bregma에 접촉시킨 후 디지털 버니어 캘리퍼스를 0으로 리셋합니다.

마이크로피펫을 브레그마(bregma) 기준 좌우로 각각 2.3 millimeters씩 차례로 이동시킵니다. Z 좌표를 기록한 후, 양측의 차이가 0.04 millimeters 미만이 될 때까지 이어바(ear bars)를 조정합니다. 브레그마에서 디지털 버니어 캘리퍼스를 0으로 리셋한 다음, 전후(anterior posterior) +1.5 millimeters, 내외(medial lateral) +0.74 millimeters 지점에 운동 피질 전지 영역(motor cortex forelimb area)을 표시합니다.

마이크로 드릴과 0.5 millimeter 원형 팁 드릴 비트를 사용하여 표시된 위치에 직경 약 0.5 millimeters의 작은 구멍을 뚫습니다. 주입 전, 두 가지 아데노 부속 바이러스 벡터를 동일한 부피로 혼합하고 샘플을 짧게 원심 분리합니다. 마이크로 주입 펌프에 연결된 유리 마이크로 피펫을 뇌 표면으로부터 배측-복측 깊이 -0.94 millimeters의 표적 부위까지 내립니다.

각 벡터 200 nanoliters가 포함된 바이러스 혼합액 400 nanoliters를 분당 50 nanoliters의 속도로 주입합니다. 주입이 완료된 후 10분이 지나면 피펫을 천천히 제거합니다. 4-0 20 millimeter, 3/8 원형 봉합사를 사용하여 두피를 봉합하고, 마우스가 완전히 회복될 때까지 가열 패드 위에 둡니다.

바이러스 주입 3~4주 후, 이전에 입증된 절차에 따라 두피 절개 단계까지 진행합니다. 두피 절개 시, 눈 주변에 충분한 피부를 남겨두면서 1.5 centimeters by 1.5 centimeters 크기로 두피를 제거합니다. 과산화수소와 0.9%saline으로 두개골을 세척합니다.

브레그마(bregma)를 확인한 후, 디지털 버니어 캘리퍼스를 0으로 리셋합니다. 0.8 millimeter 라운드 팁 드릴을 사용하여 두개골 표면을 가볍게 거칠게 만듭니다. 운동 피질의 전지 영역을 표시합니다.

전후 방향으로 1.5 millimeters, 내외측 방향으로 0.74 millimeters 지점을 잡습니다. 표시한 지점을 중심점으로 하여 5 millimeters x 5 millimeters 크기의 정사각형을 그립니다. 약 10,000 rpm의 마이크로 드릴을 사용하여 정사각형의 테두리를 따라 뚫습니다.

드릴 경로에 얼음처럼 차가운 식염수를 지속적으로 공급하고, 골편이 느슨해지면 즉시 중단하십시오. 반대측 대뇌 반구와 소뇌에 직경 0.5 millimeter의 작은 구멍 세 개를 뚫습니다. 구멍에 두개골 성형술용 나사를 식립합니다.

각 나사가 뇌경질막에 닿되, 뇌 조직의 손상을 방지하기 위해 그 이상 침투하지 않도록 주의하십시오. 포셉을 사용하여 느슨해진 골편을 제거합니다. 뇌 조직과의 직접적인 접촉을 피하면서 두개창의 뇌경질막을 제거하기 위해 0.03 mm x 0.01 mm보다 작은 초미세 팁이 달린 초미세 포셉을 사용하십시오.

옵트로드를 스테레오택식 프레임의 마이크로매니퓰레이터 암에 고정하고 두개창 위로 이동시킵니다. 옵트로드의 은색 접지와 참조 전선을 3개의 두개성형술 나사에 단단히 얽어 고정합니다. 멸균 식염수로 두개창 표면을 세척합니다.

optro를 10초당 1mm의 속도로 -0.94mm의 목표 배측-복측 깊이까지 천천히 내립니다. 이식 후 두개창 위에 아가로스 층을 도포합니다. 치과용 시멘트를 3~4층으로 도포합니다.

치과용 시멘트가 응고되면 3~5일 동안 진통제를 투여하고, 생쥐가 1~2주 동안 회복될 수 있도록 합니다. 이중 또는 삼중 파장 광섬유 광량 측정 시스템을 사용하여 GCaMP6s를 흥분시킵니다. 신호 채널은 470 nanometers로, 제어 채널은 410 nanometers로 설정합니다.

샘플링 속도를 초당 60프레임으로 조정하십시오. 이제 모든 기록 시스템 구성 요소를 적절하게 접지하십시오. 기록하는 동안 공통 중간 참조를 사용하십시오.

녹화 세션 전반에 걸쳐 노이즈를 모니터링하면서, 녹화 소프트웨어에서 광대역 및 국소 전위(local field potential) 신호가 선택되었는지 확인하십시오. 마우스를 짧게 마취시킨 후, 어댑터를 통해 optro를 녹화 라인에 연결합니다. 녹화를 위해 마우스를 홈케이지와 유사한 환경에 배치하십시오.

잠에서 깨어난 후 10분 동안 적응 시간을 줍니다. 5분 동안 분당 1회의 당기기를 수행하도록 하여 마우스의 악력 테스트 과정을 기록합니다. 다채널 및 파이버 포토메트리 시스템 모두에서 행동 테스트의 타임스탬프를 정확하게 기록하십시오.

1.5% Rose Bengal 염료 용액을 kg당 10~20 mg의 용량으로 복강 내 투여하고 5분간 대기합니다. 깊은 마취가 유도되고 유지되면 옵트로드(optrode) 프로브를 레이저 광원에 연결합니다. 이식된 옵트로드를 통해 530 nm 레이저 빔을 15 mW의 세기로 5~8분 동안 조사하여 국소 허혈을 유도합니다.

광유전학적 자극을 수행하려면 레이저 자극기를 옵트로드(optrode)에 연결하십시오. 488 nanometer 광유전학 레이저 자극기를 켜고 Opto-vTrap을 위해 10 milliwatts로 5분 동안 설정하십시오. 마지막으로, 회복을 위해 마우스를 가열 패드 위에 놓으십시오.

기저치와 비교했을 때, 광혈전증 유도 후 뇌혈류량이 감소하였으며 뇌졸중 후 1일 및 7일째에도 계속 억제된 상태를 유지했습니다. 전지 악력은 뇌졸중 후 1일째에 매우 유의미한 감소를 보였으며, 7일째에도 계속 억제된 상태를 유지했습니다. 파이버 포토메트리로 기록한 성상교세포 칼슘 과도 현상과 전기생리학적으로 측정된 뉴런 스파이크는 타임스탬프를 기준으로 정렬되었습니다.

광혈전성 뇌졸중 이후, 전완 잡기 과제 수행 중의 기저 발화율과 비교했을 때 피라미드 뉴런과 인터뉴런 모두에서 발화율이 유의하게 억제되었습니다. 기저 상태에서는 성상교세포의 칼슘 일시적 변화가 과제 시작 후 4~6초 이내에 정점에 도달했습니다. 그러나 광혈전성 뇌졸중 이후에는 진폭이 유의하게 감소하였으며, 이는 약화된 칼슘 활성을 반영합니다.

래스터 플롯(Raster plots)과 자극 주변 시간 히스토그램(peri-stimulus time histograms)을 통해 광자극 동안의 신경세포 활동 변화를 확인하였습니다. 피라미드 뉴런과 인터뉴런의 발화율 모두 자극 전 기선(baseline)과 비교하여 광자극 후 유의미하게 감소하였으며, 이는 성상교세포 조절이 국소 회로의 흥분성에 측정 가능한 하위 효과를 준다는 것을 확인시켜 줍니다. 본 프로토콜을 통해 급성 징후 발생부터 만성 단계에 이르기까지 뇌졸중 전 과정에 걸쳐 운동 능력과 신경 활동을 중단 없이 기록할 수 있습니다.

본 프로토콜의 성공 여부는 정밀하거나 조율된 정렬에 달려 있습니다. 단안 optro 임플란테이션과 수술 전반에 걸친 충분한 바이러스 발현 시간이 중요합니다. 향후 연구에서는 더 넓은 뇌 영역을 모니터링하기 위해 여러 개의 임플란트를 사용하거나, 다양한 행동 분석을 통해 서로 다른 세포 유형을 타겟팅할 수 있습니다.