생리적 맥박성 전단 응력과 진동성 고혈당 하에서 내피 기능 장애를 모델링하는 마이크로플루이딕 시스템

본 연구는 동기화된 진동성 고혈당과 맥동 전단 스트레스가 함께 당뇨병 혈관 질환에서 내피 기능 장애를 어떻게 유발하는지 조사합니다. 기존 모델은 고혈당 또는 안정적인 층류 출발을 사용합니다. 우리는 맥동성 전단 응력이 진동성 포도당 손상을 어떻게 상쇄하는지 조사합니다.

우선, 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어를 사용해 마이크로플루이딕 칩 구조를 설계하세요. SU-8 마스터 몰드는 상업 업체를 통해 제작하세요. 깨끗한 혼합컵에 폴리디메틸실록산, 경화제와 프리폴리머를 무게 기준 10:1 비율로 섞고, 손으로 5분간 세게 저어줍니다.

그 후 용기를 진공 챔버에 0.08 메가파스칼 압력으로 최소 15분간 넣어 혼합 중 갇힌 기포를 제거합니다. 폴리디메틸실록산을 유리 페트리 접시에 놓은 웨이퍼 위에 부어줍니다. 폴리디메틸실록산을 건조기에 넣어 웨이퍼에 추가로 15분간 부어 주조 과정에서 생긴 기포를 제거했습니다.

몰드와 폴리머가 들어있는 페트리 접시를 80도(섭씨)로 설정한 뜨거운 오븐에 2시간 동안 넣습니다. 메스를 사용해 마스터 몰드에서 굳어진 폴리머 슬래브를 조심스럽게 벗겨냅니다. 코어 펀치 도구를 사용해 폴리머 슬래브의 지정된 채널 끝에 입구 및 출구 포트를 만듭니다.

유리 커버 슬립과 폴리머 슬래브의 무늬 면을 접착 테이프로 닦아주세요. 다음으로, 폴리머 슬래브와 유리 덮개 슬립을 플라즈마 클리너로 65와트로 실내 공기에서 60초간 처리하세요. 즉시 폴리머 채널 면을 처리된 유리 커버 슬립의 면과 일치시킵니다.

그 후 부드럽게 눌러 영구적으로 닫힌 마이크로플루이딕 채널을 만듭니다. 결합된 마이크로플루이딕 칩을 탈이온수가 채워진 붕소화 유리병에 넣습니다. 121도 섭씨와 15파운드당 평방인치에서 20분간 오토클레이빙으로 멸균하세요.

멸균된 칩을 PBS와 저포도당 DMEM의 등몰 혼합물이 채운 60밀리미터 배양 접시에 넣습니다. 그 후 1밀리리터 주사기를 사용해 채널에 100마이크로그램/밀리리터의 피브로넥틴을 주입하고 37도 섭씨에서 4시간 배양합니다. 다음으로, 24.5밀리몰라 데마니톨을 저포도당 DMEM에 추가하여 삼투압을 높입니다.

5밀리몰라 D-포도당을 고포도당 DMEM에 첨가하여 최종 농도는 30밀리몰라 포도당을 얻습니다. 정상 포도당 배양지와 고포도당 배양지를 20% FBS와 1%페니실린 스트렙토마이신을 보충하여 준비합니다. 그 다음 PBS, 트립신, 정상 포도당 배양 배양지, 고포도당 배양지를 37도 수조에 데우세요.

배양 접시에서 인간 탯줄 내피 세포를 90% 합류율로 채취합니다. 0.25%의 트립신-EDTA 용액을 사용해 세포를 분리합니다. 세포를 37도 섭씨에서 30초간 배양한 후, 채취한 세포를 세고 정상 포도당과 고포도당 배지에 각각 1 곱하기 10의 6 세포 1곱 농도로 재현탁합니다.

1밀리리터 주사기를 사용해 100마이크로리터의 세포 현탁액을 마이크로플루이딕 칩의 입구 포트에 주입하고, 대조군에는 정상 포도당 배지, 실험군에는 고포도당 배지를 투여합니다. 마이크로플루이딕 칩을 37도 섭씨에 5% 이산화탄소가 포함된 가습 인큐베이터에 48시간 동안 넣습니다. 제시된 방정식을 사용하여 목표 펄서틸 전단 응력을 달성하는 데 필요한 유량을 계산합니다.

압력원을 압력 컨트롤러에 연결하세요. 그 다음 압력 컨트롤러를 컴퓨터에 연결된 밸브 컨트롤러와 연결하여 압력파 형태를 자동으로 제어합니다. 100밀리리터 용량의 저장소 두 개를 채우세요. 하나는 정상 포도당 배양지로, 다른 하나는 고포도당 배양 배양지로요.

저수지를 압력 조절기의 해당 채널에 연결하세요. 그 다음 리저버와 2단계 3방향 자기 밸브를 실리콘 튜브로 연결합니다. 목표 생리학적 펄서티얼 전단 응력을 분당 약 200 마이크로리터의 유량에 해당합니다.

프로그래밍 가능한 공기 펌프를 프로그래밍하여 펄서틸성 전단 응력을 유지하기 위해 사인파 함수를 생성하세요. 다음으로, 밸브 컨트롤러를 5분마다 채널을 전환하도록 프로그래밍하여 동적 자극 중에 사각파 포도당 진동을 생성합니다. 실리콘 튜브로 2단계 3방향 자기 밸브와 마이크로플루이딕 칩을 연결하세요.

그 후 튜빙을 프라이밍하기 위해 프로그래머블 펌프 시스템을 작동시킵니다. 다음으로, 직경 1.3밀리미터의 90도 각도 스테인리스 스틸 커넥터를 사용해 마이크로플루이딕 칩의 입구 및 출구 포트를 튜빙에 연결합니다. 마이크로플루이딕 칩 출구를 폐기물 저장소에 연결한 후 펌프를 다시 가동하여 진동성 포도당과 맥동 전단 응력을 총 30분 동안 전달합니다.

유동 필드 검증을 수행한 후, 제조사의 지침에 따라 실험 종료점에서 칼세인 AM과 프로피듐 요오화물 작업 용액을 준비합니다. 채널을 PBS로 한 번 헹구면, 칼세인 AM과 프로피디움 요오화물 작업 용액을 채널에 주입하고, 37도 온도에서 5% 이산화탄소와 함께 어둠 속에서 30분간 배큐합니다. 즉시 10배 대물렌즈가 장착된 역형 형광 현미경을 사용해 염색된 세포의 형광 이미지를 포착하세요.

즉시 10배 대물렌즈가 장착된 역형 형광 현미경을 사용해 염색된 세포의 형광 이미지를 포착하세요. 칼세인 AM에는 플루오레세인 이소티오시아네이트 그린 필터를, 프로피디움 요오다이드는 테트라메틸로다민 또는 로다민 레드 필터를 사용하세요. 채널을 PBS로 세 번 세척한 후, 앞서 보인 대로 살아있는 세포 산화 스트레스 형광 탐침액을 채널에 주입하고 인큐베이션합니다.

채널을 PBS로 세 번 세척하여 분리된 프로브를 제거하세요. 모든 그룹에서 동일한 노출 파라미터를 유지하면서 20배 대물렌즈를 통해 설정한 원적색 필터를 즉시 형광 이미지를 캡처하세요. 획득한 칼세인 AM 녹색과 프로피듐 요오다이드 적색 이미지를 ImageJ에서 열어보세요.

각 채널의 임계값을 수동으로 조정하여 형광 신호와 배경을 구분하세요. 셀 카운터를 사용해 형광 세포를 정량화하고, 관찰 결과를 바탕으로 최소 세포 크기를 조정하여 여러 시야에서 살아있는 세포와 죽은 세포 수를 결정합니다. 각 실험 조건에 대해 스프레드시트 소프트웨어를 사용해 살아있는 세포의 비율을 계산하세요.

그 후 통계 분석 소프트웨어를 사용해 여러 시야의 평균과 표준편차를 계산하여 그룹을 비교합니다. 선택한 이미지를 ImageJ에 드래그하세요. Analyze를 선택하고 Set Scale을 선택하여 현미경 메타데이터를 사용해 픽셀 크기를 보정합니다.

그 후 배경 뺄셈 함수를 사용하여 프로세스 선택과 배경 빼기를 선택하여 비특이적 균일 배경 신호를 제거하세요. 다음으로 이미지를 선택하고 조정(Adjust)을 선택한 후 임계값(threshold) 슬라이더를 수동으로 조정하고 세포 내 활성 산소 종 신호를 정의하세요. 측정값을 설정하려면 분석(Analysis)을 선택하고 측정값 설정(Set Measurements)을 선택하여 면적(Area)과 평균 회색 값을 포함하도록 선택하세요.

관찰된 세포 크기를 기준으로 최소 세포 크기를 결정하고 세포 단층 ROI 내에서 분할 신호의 평균 강도를 측정하려면 분석 및 분석 입자를 선택하세요. 각 실험 조건별 반응성 산소 종 농도를 칩당 최소 세 개의 무작위 선택 시야에서 도출된 측정값의 평균으로 보고하세요. 정량적 결과를 데이터 분석 및 그래프 소프트웨어에 입력하세요.

분산의 양방향 분석을 사용해 실험군과 대조군을 비교한 후 유의수준 0.05의 Tukey 사후 검정을 사용하여 통계적 유의성을 결정합니다. 소프트웨어를 사용해 분석을 수행하고, 표준편차를 나타내는 오차 바가 포함된 그래프를 생성하세요. 대표적인 형광 영상은 모든 그룹에서 생존 가능한 세포의 비율이 높았으며, 정상 포도당과 맥동성 전단 스트레스 그룹이 있는 정상 포도당에서 세포 사멸이 거의 관찰되지 않는 반면, 진동성 포도당과 진동성 포도당은 박동성 전단 스트레스 그룹에서 죽은 세포가 눈에 띄게 증가하는 모습을 보였다.

정량적 분석 결과, 진동성 포도당 노출은 대조군에 비해 세포 생존율을 유의미하게 감소시켰으며, 진동성 포도당 조건에서 맥동성 전단 스트레스 가할 경우 진동성 포도당 단독 생존률이 유의미하게 증가했습니다. 정상 포도당 상태에서는 세포 내 활성 산소 종 수치가 낮았으며, 전단 스트레스가 가해진 후 더욱 감소했다. 반면 진동성 포도당 상태는 적색 형광 강도를 현저히 증가시켜 활성 산소 종이 증가함을 나타낸다.

전단 스트레스 가한 후 진동성 포도당 유도 세포 내 활성 산소 종의 증가가 감소했습니다. 정량적 분석 결과, 전단 스트레스는 정상 포도당 조건에서 활성산소 종의 농도를 유의미하게 감소시킨다는 사실이 밝혀졌습니다. 반면, 진동성 포도당 조건은 정상 포도당에 비해 활성 산소 종 수치가 유의미하게 증가하는 결과를 초래했습니다.

더불어, 전단 스트레스는 진동성 포도당 조건에서도 활성산소 종 농도를 유의미하게 감소시켰습니다. 이 프로토콜은 ROS 수치와 세포 가용성을 정량화하여 진동성 고혈당 및 펄서틸성 전단 스트레스 하에서 내피 기능 장애를 연구할 수 있게 합니다. 이 절차 후에는 NRF2 경로나 iNOS 신호전달과 같은 분자 분석을 수행하여 내피 보호 기전을 핵적으로 제거할 수 있습니다.

향후 연구에서는 이 시스템을 이용해 기계생물학적 경로를 탐색하고, 흐름 기하학을 교란하거나 평활근 세포 공동 배양을 도입할 수 있습니다.