2026년 8월 4일
이 프로토콜의 목표는 시험관 내에서, 생체 포유류 세포 및 3차원 세포 모델에서 재현 가능한 RNA 영상 워크플로우를 위해 Riboglow 프로브의 정량적 형광 수명 측정을 가능하게 하는 것입니다. 우리는 편향되지 않은 형광 수명 측정을 추출하기 위한 샘플 준비, 프로브 전달, 데이터 수집 및 정량적 분석 워크플로우를 개괄합니다.
우리의 연구는 라이브 세포에서 RNA를 시각화하여 RNA의 시공간 역학을 조사하는 데 초점을 맞추고 있습니다. Riboglow 플랫폼은 다세포 시스템에서 정량적 형광 수명 이미지 마이크로스코피를 사용하여 건강 및 질병의 생물학적 시스템에 적용 가능합니다. 시작하려면, 구슬로 로드된 Riboglow 프로브가 있는 RNA 샘플 또는 세포를 얻으십시오.
공초점 레이저 스캐닝 현미경 시스템을 켠 다음 현미경 제어 장치를 켭니다. 시간 상관 단일 광자 계수 형광 수명 이미지 마이크로스코피 또는 FLIM 시스템을 켜고, 레이저 결합 장치, 광 증배기 검출기 및 이벤트 타이머를 포함합니다. NIS 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 열고 설정 및 구성 창에서 AX를 PicoQuant와 함께 선택합니다.
소프트웨어가 부팅되면 AX FLIM 및 FCS를 선택합니다. 형광 수명 데이터 획득을 위해 현미경을 설정하려면 AX 패드 섹션에서 Galvano가 선택되었는지 확인합니다. 평균값을 하나로 설정하고 머무르는 시간을 두 개로 설정합니다.
레이저 전력 섹션에서 개별 레이저 슬라이더를 3~4%로 낮추고 모든 레이저 슬라이더를 하나로 설정합니다. 20X 목적을 선택한 후 스캔 영역 설정에서 512x512를 선택하고 검출기를 켭니다. 데이터 파일 경로를 정의하려면 컨트롤러 섹션 하단으로 이동하여 구성을 선택합니다.
PicoQuant 또는 FLIM FCS 탭을 클릭한 후 작업 공간 경로에서 오른쪽의 폴더 기호를 선택합니다. 저장 위치에서 하루의 실험을 위한 새 폴더를 만들고 구성 창을 닫습니다. 라이브가 선택되고 이미지 획득 창이 나타나면 라이브를 다시 선택하여 광자 수집을 일시 중지합니다.
형광 수명 이미지 마이크로스코피 또는 FLIM 데이터 수집 창을 설정하려면 라이브 이미지 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 PicoQuant 플러그인을 선택합니다. 감쇠 곡선 표시, 시간 추적 표시 및 FLIM 통계 표시를 활성화합니다. 세포 실험을 위한 레이저 배열을 설정하려면 페이지 상단 오른쪽의 실험 설정으로 이동합니다.
다중 채널 염료 상자 옆의 추가를 클릭한 후 원하는 염료를 추가합니다. 전문가 모드를 선택합니다. 각 방출 스펙트럼에 대한 검출기 할당을 조정합니다.
중복되는 흥분 및 방출 스펙트럼을 다른 검출기로 분류합니다. 왼쪽 패널에서 통과 순서를 조정하여 중복되는 흥분 및 방출 스펙트럼을 가진 염료 간의 교란을 최소화합니다. 새 레이저 구성을 저장하고 이름을 지정한 후 실험을 위해 저장된 구성을 선택합니다.
라이브 획득 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 획득 제어를 선택한 다음 XYZ 개요를 선택합니다. FLIM을 위해 이미지 셀 배양 접시를 로드하기 전에 라이브 셀 핵 염색을 추가하고 벤치에서 부드럽게 회전하여 철저히 혼합하고 30초 동안 둡니다.
이미지 접시를 현미경 무대에 놓습니다. 접시를 현미경 무대의 하단 왼쪽 모서리로 밀어 넣습니다. 공기가 아닌 목적을 사용할 때 XY 드리프트를 방지하기 위해 무대에 샘플을 테이프로 고정합니다.
4'6-다이아미디노-2-페닐인돌 또는 DAPI 채널로 전환합니다. 셀 핵이 초점에 들어올 때까지 컨트롤러 노브를 사용합니다. 필요한 경우 Z 높이 노브 감도를 조정하고 셀이 보이지 않으면 XY 좌표를 조정합니다.
완벽한 초점 시스템 또는 PFS 자동 초점을 활성화하려면 AX 패널의 오른쪽 측면에서 PFS 버튼 옆에 있는 확대
본 논문은 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)을 사용하여 살아있는 포유류 세포 내 RNA 분자의 정량적 시각화를 가능하게 하는 유전적으로 인코딩된 RNA 바이오센서 시스템인 Riboglow-FLIM의 상세 프로토콜을 제시합니다. 이 워크플로우는 시료 준비, 이미지 획득 및 정량적 분석을 다루며, 통제된 환경과 살아있는 세포 환경 모두에서 RNA 역학 및 상호작용 연구를 용이하게 합니다.
살아있는 포유류 세포 내 RNA의 정량적 시각화는 특히 비코딩 RNA의 역학과 조절 기전을 이해하는 데 있어 초기 단계의 신약 개발을 위한 매우 중요한 과제입니다. Riboglow-FLIM 워크플로우는 복잡한 세포 환경에서 RNA의 국소화 및 상호작용에 대한 견고하고 재현 가능한 측정을 가능하게 하여, 타겟 검증 및 기전적 리스크 감소에 대한 예측 신뢰도를 높여줍니다. 이러한 역량은 정량적이고 공간적으로 분해된 RNA 데이터를 제공함으로써 발견 단계부터 전임상 연구까지의 중개 연구 연속성을 강화합니다.
Riboglow-FLIM 프로토콜은 in vitro 검증부터 살아있는 세포 및 3차원 모델 분석에 이르기까지 정량적 RNA 이미징을 가능하게 함으로써, 발견 단계부터 전임상 단계까지의 연속적인 연구 과정에 통합됩니다.