대장균 세포 침범의 정량화 및 시각화를 위한 아미카신 보호 분석

우리는 침입성 대장균이 장 상피 세포를 침범하는 방식을 규명하고, 이 과정에 기여하는 박테리아 요인을 규명하는 데 중점을 둡니다. 겐타마이신 내성 분리주는 전통적인 침입 검사를 제한합니다. 이 아미카신 기반 프로토콜은 세포 내 박테리아의 정확한 정량화를 가능하게 합니다.

우선, 침입 분석에 필요한 모든 시약과 매개체를 모으세요. 다음으로, 80도 냉동고에서 침입성 Escharicia colli(AIEC) 균주의 냉동 글리세롤 재고를 꺼내세요. 멸균된 나무 막대기나 피펫 팁을 사용해 줄기에서 박테리아를 부드럽게 긁어내어 루리아-베르타니(LB) 오거 플레이트에 스트레이크하여 단일 군집을 얻습니다.

플레이트를 37도 섭씨에서 하룻밤 배양하세요. 다음 날, 멸균된 나무 막대기나 피펫 팁을 사용해 오거 플레이트에서 하나의 군집을 골라냅니다. 군체를 3밀리리터의 LB 육수에 접종하고, 37도 섭씨에서 분당 200회전으로 하룻밤 배양합니다.

그 다음 1밀리리터 LB 육수에 1에서 10까지 배양물을 희석합니다. 분광광도계를 사용해 희석된 배양물 600나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 100마이크로리터의 100마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 옮기고, 6,000G에서 4도 섭씨에서 10분간 원심분리합니다.

세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 흡입한 후, 1밀리리터의 혈청과 항생제-항진균제가 없는 배지에 다시 현탁하세요. 제공된 공식을 사용하여 감염 배수(MOI)를 달성하기 위해 필요한 박테리아 부유량을 계산합니다. 감염 배지를 준비하기 위해, 계산된 박테리아 현탁액을 멸균 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 옮기고, 혈청과 항생제-항균제가 없는 배지로 1밀리리터로 보충합니다.

피펫을 위아래로 여러 번 움직여 부드럽게 섞으세요. 멸균된 1X PBS에서 10배 연속 희석을 수행하여 희석된 밤샘 박테리아 배양의 밀리리터당 집락 형성 단위를 96웰 플레이트를 준비합니다. 희석된 하룻밤 배양액 200마이크로리터를 플레이트의 첫 번째 웰에 옮깁니다.

다음 행에 1X PBS 180마이크로리터를 피펫으로 20마이크로리터 배양액을 피펫 주입합니다. 피펫을 10번 위아래로 섞고, 희석 과정을 반복하여 새 피펫 팁을 사용해 10의 6제곱에 도달할 때까지 반복하세요. 이제 10마이크로리터의 스팟 희석액을 10에서 2의 제곱, 10의 희석제곱에서 6번의 희석제곱까지 3중으로 LB 오거 플레이트에 도판합니다.

불꽃 근처에서 얼룩이 오거에 흡수되도록 두세요. 판을 27도에서 30도 섭씨에서 하룻밤 부양하여 군체 과잉 성장을 방지하고 명확한 개별 군집을 확보하세요. 인큐베이터에서 콜라겐 코팅된 24웰 배양판에서 배양된 건강한 융합형 Caco-2 상피세포 단층을 제거하고, 각 웰에서 전체 배지를 압취합니다.

각 웰에 혈청과 항생제-항균제가 없는 배지 1밀리리터를 피펫팅합니다. 매체에 흡입하여 매체 흔적을 제거하고, 한 번 더 세척을 반복하여 총 두 번 세척합니다. 이제 Caco-2 세포가 포함된 24웰 플레이트의 각 웰에 미리 준비된 AIEC를 감염 배지를 1밀리리터씩 추가합니다.

24웰 플레이트를 500G에서 실온에서 15분간 원심분리하여 박테리아가 상피 단층과 접촉을 동기화하고, 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 3시간 동안 배양하여 박테리아 침입을 허용합니다. 미리 예열된 혈청 및 항생제-무균 배지에 240마이크로그램/밀리리터의 아미카신을 첨가하여 항생제 함유 배지를 준비합니다. 감염 기간 후에는 Caco-2 세포 단층에서 배지를 흡입하고, 각 웰을 1밀리리터의 혈청과 항생제-항균제가 없는 배지로 세척합니다.

매체를 흡입한 후 다시 한 번 세척을 반복하여 총 두 번 세척합니다. 그 후 각 웰에 240마이크로그램/밀리리터 아미카신 함유 배지를 피펫 1밀리리터 주입합니다. 병행하여 다른 세포 세트에 100마이크로그램/밀리리터 겐타미신을 투여하여 비교하고, 세포를 37도 온도에서 5% 이산화탄소와 함께 1시간 배양하여 세포외 박테리아를 제거합니다.

인큐베이션 후에는 각 웰에서 매체를 흡입하세요. 부착된 박테리아를 씻어내기 위해 PBS 1밀리리터를 추가하세요. PBS를 흡입한 후 세척을 한 번 더 반복하면 총 두 번 세척할 수 있습니다.

이제 각 웰에 1% Triton X100을 희석한 200마이크로리터를 추가하고, 분당 90회전으로 궤도 셰이커에서 10분간 배양하여 상피세포를 용해합니다. 웰당 피펫을 약 30번 위아래로 움직여 세포를 플레이트에서 분리하세요. 다음으로, PBS를 사용해 96웰 플레이트에서 세포 용해액을 10배 연속 희석합니다.

LB 오거 플레이트에 희석하지 않은 점적 희석액 10마이크로리터를 3배로 3배로 적재합니다. 반점이 마른 후에는 플레이트를 27도에서 30도 섭씨에서 하룻밤 사이 배양하여 깨끗한 개별 군락을 얻습니다. 배양 후에는 플레이트를 제거하고, 적절한 점적 희석에서 3중체 전반에 걸쳐 7개 이상의 군락을 포함하는 잘 분리된 군락을 세어보라.

마지막으로, 방정식을 사용하여 밀리리터당 및 퍼센트 침입률당 접종 및 집단 형성 단위를 계산합니다. 침습성 AIEC 균주 NRG857c나 비침습적 대장균 DH5 알파 균주로 Caco-2 세포 단층 감염 후 겐타마이신 또는 아미카신으로 치료했을 때도 유사한 침습 프로파일을 보였습니다. 이 발견들은 아미카신이 세포외 박테리아를 제거하는 데 겐타마이신만큼 효과적이며, 세포 내 박테리아 부하를 정확히 반영함을 시사했다.

염증성 장 질환 환자로부터 얻은 겐타마이신 내성 임상용 대장균 분리주를 겐타마이신으로 치료하면, 약 21에서 2,788%에 이르는 매우 변동적인 세균 회복 값을 나타냈습니다. 반면, 아미카신 치료는 모든 분리주에서 세균 회복을 극적으로 감소시켜 효과를 입증하고 보다 신뢰할 수 있는 침투 측정을 가능하게 했습니다. 이 프로토콜은 세포 내 박테리아의 정확한 정량화와 상피세포 내 박테리아 침입 평가를 가능하게 합니다. 면역형광 현미경과 같은 추가 방법도 세균 침입 검증과 세포 내 위치 확인을 위해 사용될 수 있습니다.

향후 연구는 새로운 병원성 인자를 규명하고 침습성 대장균 감염 시 표적이 되는 숙주 경로를 조사할 수 있을 것입니다.