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</ol>

<table><tbody><tr><td>100 mm 플레이트</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>45 µm 필터&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLHVM33RS</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>96웰 블랙 클리어 바닥 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS356259</td><td>CellTiter-Glo 발광 세포 생존도 분석</td></tr><tr><td>블라스티시딘</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113903</td><td>선택을 위해</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 발광 세포 생존도 분석</td><td>CellTiter-Glo, Promega</td><td>G7570</td><td>CellTiter-Glo 발광 세포 생존도 분석</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td></td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3672,0050</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>Ham&rsquo;s F12 영양 혼합물</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>HEK293T 세포</td><td></td><td></td><td>Robert Weinberg(미국 보스턴 MIT)의 친절한 선물.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001-1G</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>LentiCas9-blast</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52962</td><td>Cas9-안정 세포주 생성을 위해</td></tr><tr><td>LentiGuide-Puro&nbsp;</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52963</td><td>gRNA 클로닝의 백본</td></tr><tr><td>MN NucleoSpin 조직 키트</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.5</td><td>게놈 DNA 추출</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10010023</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>pLentiCRISPR v2&nbsp;</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52961</td><td>gRNA 클로닝의 백본</td></tr><tr><td>폴리에틸렌글리콜(PEG)-8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2139-500G</td><td>렌티바이러스 농축</td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민, 선형(PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>765090-1G</td><td>렌티바이러스 생산</td></tr><tr><td>프로타민 설페이트(PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4380-25G</td><td>렌티바이러스 감염</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene&nbsp;</td><td># 12260</td><td>렌티바이러스 생산</td></tr><tr><td>푸로마이신</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td>선택을 위해</td></tr><tr><td>SUM159PT 부착 세포</td><td></td><td></td><td>Robert Weinberg(미국 보스턴 MIT)의 친절한 선물.</td></tr><tr><td>탁솔</td><td>팍리탁셀, 시그마</td><td>PHR1803-200MG</td><td>RES 세포 생성 및 유지</td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.05%)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>25300054</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>베라파밀</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S4202</td><td>선택을 위해</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene&nbsp;</td><td># 8454</td><td>렌티바이러스 생산</td></tr></tbody></table>

화학저항성 세포에 대한 후생유전체 전체 crispr-cas9 기반 녹아웃 스크리닝

Epigenome-Wide CRISPR-Cas9-Based Knockout Screens on Chemoresistant Cells

화학저항성 세포에 대한 후생유전체 전체 CRISPR-Cas9 기반 녹아웃 스크리닝

Chemotherapy resistance remains a major challenge in cancer treatment, driven by cancer cells&#39; ability to acquire adaptive properties, rewire ...

우리는 CRISPR 기반 스크리닝 접근법을 사용하여 삼중 음성 유방암의 화학 요법 내성을 유도하는 후성유전학적 메커니즘을 조사합니다. 우선, 제시된 성분들이 보충된 Ham's F-12 Nutrient Mix를 사용하여 96-웰 블랙-투명 바닥 플레이트의 웰당 약 2 × 10³개의 159 PT 부착 세포를 분주합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건의 세포 배양 인큐베이터에서 16시간 동안 배양합니다.다음으로, dimethyl sulfoxide 또는 DMSO에 용해된 Taxol 스톡 용액을 준비합니다. 세포를 처리하기 위해, 배양액에서 Taxol을 0.3 nanomolar에서 10 micromolar 범위로 단계 희석하여 준비하고, DMSO 단독 처리군을 용매 대조군으로 사용합니다. 세포에 증가하는 농도의 Taxol 200 microliters를 3반복으로 처리합니다.플레이트를 37°C, 5% 이산화탄소 조건의 세포 배양 인큐베이터에서 72시간 동안 배양합니다. 약물 처리 72시간 후, 발광 기반 ATP 정량 분석법을 사용하여 세포 생존능을 평가합니다. 마이크로플레이트 리더로 발광도를 측정하고, 그 결과를 DMSO 대조군 값으로 표준화합니다.다음으로, 적절한 통계 소프트웨어에서 4-파라미터 로지스틱 용량 반응 모델을 이용한 비선형 회귀 분석을 통해 10% 및 50% 억제 농도 값을 계산합니다. 화학저항성 세포를 생성하기 위해, 6-웰 플레이트의 각 웰에 2 × 10⁵개의 159 PT 세포를 분주합니다. 그리고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 2mL의 배양 배지에서 10% 또는 50% 억제 농도의 Taxol로 세포를 72시간 동안 처리합니다. 세포가 현재의 약물 농도를 견디는 경우, 세포를 두 개의 웰로 나누어 분할합니다. 하나는 신선한 배지를 사용하여 백업 대조군으로 유지하고, 다른 웰에서는 Taxol 농도를 두 배로 높입니다.내성 세포를 생성하는 동안, 대조군으로서 DMSO가 포함된 배지에서 모세포를 계대 배양하고, DMSO의 부피를 해당 Taxol 처리군에 포함된 양과 일치하도록 조정하십시오. 모세포와 내성 세포주 간에 50% 억제 농도(IC50) 값에서 유의미한 차이가 관찰될 때까지 3~4주마다 세포 생존율을 측정하십시오. 안정적인 내성 세포는 용량 증량 과정에서 사용된 최종 Taxol 농도에서 유지하십시오.내성 세포의 특성 분석을 위해, 약물 존재 하에서 RNA 시퀀싱, 웨스턴 블로팅, qPCR 및 세포 생존력 분석을 수행합니다. 159 PT Taxol 내성 세포와 모세포를 96웰 블랙-투명 바닥 플레이트에 웰당 2 × 10³ cells의 밀도로 3회 반복 분주합니다. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.모든 처리 조건에서 Taxol 농도를 일정하게 유지하면서, 80 µM에서 1.25 µM 범위의 verapamil을 2배 연속 희석하여 세포를 처리합니다. 72시간의 처리 후, 발광 기반 ATP 정량 분석법을 사용하여 세포 생존율을 평가합니다. 내성 세포에서 감수성을 회복시키면서 세포 생존율을 유지하는 verapamil 농도를 결정합니다.베라파밀과 함께 사용할 퓨로마이신 농도를 결정하기 위해, 159 PT Taxol-내성 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 2 × 10³ cells의 밀도로 분주합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 16시간 동안 배양합니다. 앞서 결정된 베라파밀 농도가 포함된 배지 내에서 퓨로마이신을 40에서 0.625 µg/mL 범위로 2배 연속 희석하여 준비합니다.세포를 각각의 puromycin 희석액으로 72시간 동안 처리합니다. 생존율 분석 후, verapamil 존재 하에 생존율을 5% 이하로 감소시키는 가장 낮은 puromycin 농도를 확인합니다. 그런 다음 일부 159 PT Taxol-내성 세포를 사용하여 바이러스 역가(viral titration)와 감염 다중도(multiplicity of infection)를 계산합니다.원하는 감염 다중도(MOI)에 따라 계산된 부피의 Cas9 렌티바이러스를 8 µg/mL의 프로타민 황산염이 포함된 배양 배지 내의 세포에 직접 첨가합니다. 감염 16시간 후 바이러스 배지를 신선한 배지로 교체합니다. 다음 날, 배양 배지를 이전에 결정된 농도의 블라스티시딘(blasticidin)이 포함된 배지로 교체하여 블라스티시딘 선택 과정을 진행합니다.비감염 세포가 제거될 때까지 선택 과정을 계속합니다. 필수 유전자를 대상으로 한 대조군 단일 가이드 RNA를 사용하여 Cas9 활성을 검증하거나, GFP를 리포터로 사용하여 넉아웃 효율을 평가합니다. 제시된 식을 사용하여 원하는 라이브러리 커버리지에 도달하는 데 필요한 성공적으로 감염된 세포 수를 계산합니다.각 생물학적 반복 실험을 위해 독립적인 감염 혼합물을 준비합니다. 앞서 계산된 세포를 분주한 후, 8 $\mu\text{g/mL}$의 protamine sulfate가 포함된 8 mL의 완전 배양 배지 내에 정해진 양의 바이러스를 넣어 감염시킵니다. 16시간 후, 바이러스 배지를 신선한 배지로 교체하고 세포를 37 °C, 5% $\text{CO}_2$ 조건에서 배양합니다.일부 159 PT Taxol 내성 세포에서 sg-RNA 감염 세포를 농축하기 위해, 이전에 결정된 농도의 verapamil 존재 하에 puromycin 선택을 적용합니다. 감염되지 않은 대조군 플레이트의 모든 세포가 제거될 때까지 선택 과정을 계속합니다. 일반적으로 약 3일 정도 소요됩니다.puromycin 및 verapamil 선택 과정을 마친 후, 세포를 trypsin 처리하고 형질도입 시 결정된 커버리지 수준에 해당하는 각 생물학적 반복구로부터 초기 시점인 0시간째 세포 펠릿을 수집합니다. 커버리지를 유지하면서 세포를 실험군으로 나눕니다. 한 군은 DMSO를 처리한 대조군으로 설정합니다.그리고 나머지는 Taxol 처리군으로 설정합니다. 배양물을 14~16회의 세포 집단 배가(population doublings) 동안 유지합니다. 지정된 공식을 사용하여 세포 집단 배가 수준을 계산합니다.매 계대 시 세포 생존율과 성장 속도를 모니터링하십시오. 병목 현상을 방지하기 위해 적절한 세포 수를 유지하십시오. 원하는 세포 집단 배가 수준에 도달하면, 펠릿당 라이브러리 커버리지를 유지하면서 각 반복구 및 조건별로 최종 시점의 펠릿을 수집하십시오.이후 게놈 DNA 추출 단계까지 펠릿을 -80 °C에서 보관하십시오. 내성 세포는 Taxol 처리에도 불구하고 계속 증식한 반면, 모세포는 동일한 처리 조건에서 생존하지 못했습니다. RNA 시퀀싱 결과, 내성 세포에서 ABCB1이 가장 많이 상향 조절된 유전자 중 하나로 확인되었으며, ABCB4 및 ABCA5를 포함한 다른 ABC 수송체들이 그 뒤를 이었습니다.내성 세포에서 ABCB1 발현의 상향 조절은 정량적 PCR을 통해 검증되었습니다. Taxol 내성 세포는 다약제 내성 표현형을 보였으며, doxorubicin 및 vincristine에 대해 내성을 나타냈습니다. puromycin은 ABCB1 매개 약물 유출을 통해 세포 밖으로 배출될 수 있으므로, 내성 세포에서의 puromycin 선택 과정은 효율적이지 않을 수 있습니다.베라파밀(Verapamil) 단독으로는 세포 생존능에 영향을 주지 않았습니다. 그러나 항암제와 병용했을 때, 베라파밀은 이러한 약제들에 대한 민감도를 회복시켰습니다. 또한, 독성이 없는 용량의 베라파밀은 Taxol 내성 세포에서 퓨로마이신(puromycin) 민감도를 회복시켰습니다.DMSO 또는 Taxol 처리 조건의 최종 시점 샘플을 초기 시점과 비교했을 때, 거의 모든 필수 유전자가 녹아웃 시 결핍되어 스크리닝 품질이 확인되었습니다. 반면, DMSO 처리군과 Taxol 처리군의 최종 시점 샘플을 비교했을 때는 이러한 유전자들이 두 그룹 모두에서 여전히 필수적이기 때문에 필수 유전자의 결핍이 나타나지 않았습니다. 대신, 이 비교를 통해 Taxol 민감성을 높이는 후성유전학적 조절 인자들을 발견할 수 있었습니다.Taxol 내성 세포에서 수행된 EPIKOL 스크리닝 결과, 다수의 양성 대조군 유전자와 후성유전학적 조절 인자들이 유의미하게 결핍되었습니다. ABCB1을 표적으로 하는 단일 가이드 RNA는 Taxol 처리군에서 특이적으로 결핍되었으며, 이를 통해 ABCB1이 해당 스크리닝에서 Taxol 민감도에 대한 양성 대조군임을 확인하였습니다. 본 프로토콜을 통해 연구자들은 암 모델에서의 치료 내성을 연구하고, CRISPR 스크리닝 플랫폼을 이용하여 화학요법 내성의 후성유전학적 조절 인자를 규명할 수 있습니다.화학요법 내성 세포를 스크리닝할 때 가장 중요하게 고려해야 할 점은 라이브러리의 대표성을 유지하고 트랜스덕션 및 선택 조건을 최적화하는 것입니다. 향후 연구에서는 다제내성 암세포의 치료적 취약점을 식별하고 화학요법 내성을 극복하기 위한 새로운 병용 접근법을 개발할 예정입니다.

epigenome-wide-crispr-cas9-based-knockout-screens-on-chemoresistant

Research

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