옥수수 감수세포에서의 3차원 면역 위치

본 연구는 옥수수 수성 감수분열 세포를 연구하고 단일 세포 내의 감수분열 단백질을 시각화하기 위한 3D 접근법을 개발하는 데 중점을 둡니다. 옥수수 외에도 본 프로토콜은 벼, 호밀, 보리, 밀의 감수분열 세포 연구에 적용할 수 있습니다. 먼저, 화서가 여전히 줄기 내부에서 성장하고 있는 V13 단계의 옥수수 식물을 준비하십시오.

감수분열 약 고정 주간에, 장갑을 착용한 상태에서 팽대된 줄기의 돌출부를 가볍게 눌러 절개하기에 충분히 부드러운지 확인하십시오. 필요한 완충액을 준비한 후, 플라스틱 상자 안에 습윤지를 5~10장 넣어 습윤 챔버를 준비하십시오. 챔버 내의 과도한 물은 제거하십시오.

면도날을 사용하여 화서 높이에서 줄기를 절개하여 수술가지와 측가지가 드러나게 합니다. 측가지를 분리하여 수집한 후, 챔버를 실온으로 유지하면서 습윤 챔버 타월로 감쌉니다. 실체 현미경을 사용하여 소화에서 신선한 꽃가루 주머니를 수집하여 2 mL의 1X buffer A 또는 BA가 담긴 35 mm 페트리 접시에 넣습니다. 크기와 색상을 기준으로 감수분열 단계를 식별합니다.

약(anther)을 새로운 35mm 페트리 접시에 옮긴 후, 약에 고정액 3mL를 첨가합니다. 포름알데히드의 증발을 막기 위해 페트리 접시를 파라필름으로 밀봉합니다. 35mm 페트리 접시를 회전 쉐이커 위에 놓인 더 큰 페트리 접시 위에 올리고, 상온에서 40~60 RPM으로 45분 동안 설정합니다.

꽃약(anthers)을 3 mL의 1X BA로 헹굽니다. 꽃약을 작은 페트리 접시에 옮긴 후, 페트리 접이를 밀봉하고 실온의 회전 쉐이커(rotary shaker)에서 속도를 40~60 RPM으로 설정하여 45분 동안 둡니다. 깨끗한 핀셋을 사용하여 꽃약을 3 mL의 1X BA가 들어 있는 작은 35 mm 페트리 접시로 옮깁니다.

페트리 접시를 파라필름으로 단단히 밀봉한 후, 작은 페트리 접시를 더 큰 페트리 접시 안에 넣으십시오. 알루미늄 호일로 덮은 다음, 사용 전까지 시료를 4 °C에서 보관하십시오. 1일 차에, acrylamide와 2 XBA를 동일한 부피로 혼합하여 2 mL의 acrylamide 용액을 준비하십시오.

sodium sulfite와 ammonium per sulfate를 첨가하기 전, vacuum 상태에서 acrylamide 용액을 5~10분 동안 탈기합니다. 준비된 슬라이드 수에 맞춰 acrylamide와 2 XBA 혼합액을 1:1 비율로 섞어 100 µL씩 1.5 mL 튜브에 분분주합니다. 2 cm x 2 cm 크기의 parafilm 조각을 Petri dish 위에 덮고, 이를 해부용 실체 현미경 아래에 배치합니다.

가위로 피펫 팁을 다듬은 후, 약(anthers)이 포함된 BA 용액 50 µL를 파라필름 위에 분주합니다. 파라필름의 다른 영역에 BA 용액 25 µL를 분주합니다. 핀셋으로 약을 잡은 다음, 메스를 사용하여 끝부분을 절단합니다.

감수분열세포(meiocytes)를 짜낸 후, 피펫을 사용하여 25 µL의 BA 방울 속으로 옮기고 부드럽게 섞어줍니다. 감수분열세포 혼합액 10 µL를 별도의 커버슬립 위에 분주합니다. 아크릴아마이드와 2X BA가 들어있는 1.5 mL 튜브에 아황산나트륨 5 µL와 과황산암모늄 5 µL를 빠르게 첨가합니다.

이 혼합물 5 µL를 커버슬립 위에 피펫팅하고 감수분열 세포(meiocytes)와 섞어줍니다. 그 위에 폴리라이신(poly-lysine)이 코팅된 커버슬립을 45도 각도로 덮습니다. 상온에서 30~50분 동안 완전히 중합되도록 기다린 후, 면도날을 사용하여 커버슬립을 조심스럽게 분리합니다.

그런 다음, 패드 면이 위로 오도록 페트리 접시에 놓습니다. 실온에서 1mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)와 1% Triton이 첨가된 1XPBS 1mL로 커버슬립을 2시간 동안 세척합니다. 검출 과정에서 신호가 명확히 구분될 수 있도록 서로 다른 숙주 종에서 유래한 1차 항체들을 준비하여 혼합합니다.

희석된 1차 항체 50 µL를 패드가 포함된 커버슬립 중앙에 추가합니다. 그런 다음 페트리 접시를 습윤 챔버에 넣고 하룻밤 동안 둡니다. 둘째 날에 1X PBS, 0.1% Tween 20 및 1 mM EDTA가 포함된 세척 완충액 500 mL를 준비합니다.

피펫을 사용하여 하룻밤 동안 반응시킨 용액을 제거합니다. 1 mL의 세척 완충액으로 커버슬립을 두 번 세척합니다. 완충액을 제거한 후, 다시 1 mL의 세척 완충액을 첨가하고 상온에서 1시간 동안 배양합니다.

이 세척 단계를 7회 더 반복합니다. 마지막 세척 후, 디쉬를 덮고 습윤 챔버에서 하룻밤 동안 보관합니다. 2차 항체를 블로킹 버퍼로 1:50 비율로 희석하여 준비합니다.

세척액을 제거한 후, 희석된 2차 항체 50 µL를 각 패드의 중앙에 첨가합니다. 그런 다음 페트리 접시를 습윤 챔버에 넣고 상온에서 2시간 동안 둡니다. 웰에서 용액을 제거한 후, 상온에서 1 mL의 세척 버퍼로 각각 1시간씩 4회 세척합니다.

웰을 1 mL의 PBS로 10분 동안 세척하고, 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 최종 농도가 1 µg/mL가 되도록 준비한 500 µL의 DAPI를 웰에 넣고 상온에서 30분 동안 배양합니다. 4 °C에서 보관한 prolonged gold를 꺼내 상온에서 해동합니다.

슬라이드를 1 mL의 PBS로 30분 동안 세척하고 이를 2회 반복합니다. 마지막 세척액을 제거한 후, 패드 중앙에 prolonged antifade를 두 방울 떨어뜨립니다. 웰에서 커버슬립을 들어 올린 후, 라벨이 부착된 슬라이드 위에 마운트합니다.

진공 장치를 사용하여 커버슬립 가장자리의 과잉 글리세롤을 제거하고 매니큐어를 두 번 칠해 밀봉합니다. 적절한 여기 파장과 필터를 사용하여 현미경으로 슬라이드를 관찰하고 이미지를 캡처합니다. DAPI 염색 결과, 명확한 핵과 염색질 염색이 나타났으며, 이와 함께 플라스티드 및 미토콘드리아 DNA의 더 희미한 천연 세포질 염색이 관찰되었습니다.

전레프티네마(preleptinema) 단계 동안 염색체와 세포질에 위치한 AFD1(absence of first division one), ASY1(asynaptic one) 및 ZYP1(Zipper1)의 분포를 관찰하였다. 이후 단계에서는 신호가 염색체에 집중된 반면, 완전한 접합(synapsis)이 일어나기 전까지 상당량의 ZYP1이 세포질에 남아 있었다. 감수분열 코헤신인 AFD1은 지고네마(zygonema) 단계 이후에야 선형 구조를 형성하였다.

접합사 복합체의 선형 필라멘트 형성과 동시에, ZYP1과 AFD1이 선형 구조에 탑재된 후 ASY1 신호는 상대적으로 약해졌습니다. 이 프로토콜을 통해 연구자들은 단백질 공국소화 및 역학, 천연 세포 내 국소화, 3D 염색체 구조, 감수분열 진행 및 단계 설정을 연구할 수 있습니다.

이 프로토콜의 주요 과제는 1차 및 2차 항체의 호환 가능한 조합을 신중하게 선택하는 것입니다. 후속 연구에서는 수컷과 암컷의 감수분열을 비교함으로써 athelchasmi의 기저에 있는 분자 메커니즘을 조사하여 본 연구를 확장할 수 있습니다.