Name: 비드 기반 액틴 코멧 꼬리 운동성 분석법을 이용한 마이오신-I 매개 분지 액틴 조립의 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-09-03T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 배우세요 비드 기반 액틴 코멧 꼬리 운동성 분석법을 이용하여 마이오신-I 매개 분지 액틴 조립을 재구성하고 정량적 분석하는 방법을 익히세요. 이 기법은 세포 골격 역학 연구에 활용됩니다.

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단백질 정제 과정에서 훌륭한 기술적 지원을 제공해주신 Daniel Safer 박사와 Rick Wike 님께 감사드립니다. Arp2/3 복합체와 CapZ 단백질을 너그럽게 제공해주신 Roberto Dominguez 박사, 특히 Malgorzata Boczkowska 박사와 Grzegorz Rebowski 박사님께 감사드립니다. 또한 프로젝트 전반에 걸쳐 귀중한 의견을 주신 Luther Pollard 박사, Faviolla A. Báez-Cruz 박사, 그리고 Ostap 및 Dominguez 연구실의 모든 구성원분께 감사드립니다. 본 연구는 국립보건원(National Institutes of Health) 연구비 R37 GM057247 (E.M.O. 수혜)의 지원을 받았습니다. E.M.O.와 M.X.는 국립과학재단(National Science Foundation, CMMI-1548571)의 부분적인 지원을 받았습니다. 원고 수정 과정에서 언어 교정을 위해 ChatGPT가 사용되었습니다. 저자들은 AI가 보조한 모든 내용을 검토 및 수정하였으며, 최종 원고에 대해 모든 책임을 집니다.

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저자들은 경쟁 관계에 있는 재정적 이해관계나 이해상충이 없음을 밝힙니다.

액틴 꼬리-비드 운동성 분석(actin comet-tail bead motility assay)은 Arp2/3 복합체 매개 분지형 액틴 조립과 돌출력 생성에서의 역할을 연구하기 위해 잘 확립된 in vitro 재구성 시스템입니다14,15,16,17. 이 시스템은 분지형 액틴 조립의 생화학적 조절14,15,26,27,31,49,50,51 및 힘 생성20,21,22,23,52을 분석하는 데 널리 적용되어 왔으며, 액틴 네트워크의 창발적 활성 물질 특성에 대한 정량적 연구를 위한 틀을 제공해 왔습니다19,35,36,53. 이 재구성 시스템에 마이오신, 특히 myosin-I18을 통합함으로써, 수정된 분석법을 통해 마이오신-액틴 결합이 막 계면에서의 액틴 조립 및 힘 생성에 어떻게 영향을 미치는지 조사할 수 있으며, 이는 상대적으로 연구가 부족한 분야입니다. 특히, 이 시스템에서 myosin-I은 다른 마이오신 모터로 쉽게 교체될 수 있어 액틴 네트워크 리모델링 및 힘 생성에서 각각의 역할을 조사할 수 있습니다. 예를 들어, myosin V (화물 운송)54, myosin VI (엔도사이토시스 수송 및 막 역학)55,56, myosin VII 및 XV (부동모 및 미세융모 조직화)57,58,59, myosin X (사상위족 형성)60,61, 그리고 myosin XIX (미토콘드리아 역학)62을 도입하여 서로 다른 클래스의 마이오신이 액틴 조직화와 관련 생리적 과정에 어떻게 기여하는지 연구할 수 있습니다.
몇 가지 핵심 파라미터를 세심하게 제어한다면 본 분석법은 매우 높은 재현성을 보입니다. 첫째, 강력한 꼬리(comet-tail) 형성을 위해서는 고품질의 단량체 G-actin이 필수적입니다. 확립된 프로토콜41을 사용하여 토끼 골격근 아세톤 분말로부터 G-actin을 정제할 것을 권장합니다. 2~3일간의 투석 후, 단량체 액틴은 G-buffer(2 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.2 mM ATP; 0.1 mM CaCl2; 1 mM NaN3; 및 0.5 mM DTT) 내의 Sephacryl S-300 겔 여과를 통해 추가로 정제되어야 합니다. 용출 피크 직후에 수집된 분획을 사용해야 합니다. 정제된 G-actin은 4°C 얼음 위에서 보관할 때 일반적으로 2~3주 동안 강력한 중합 활성을 유지하며 4주 차까지 사용 가능할 수 있으나, 그 이후에는 일반적으로 성능이 저하됩니다. 희소하고 부서지기 쉬운 액틴 네트워크와 일관성 없는 꼬리 성장을 특징으로 하는 꼬리 강도의 저하는 흔히 액틴 품질의 저하를 나타냅니다. 둘째, NPF 활성은 꼬리 형성 여부를 결정짓는 결정적인 요소입니다. 인간 신경계 Wiskott–Aldrich 증후군 단백질(N-WASP) 유래 상용 GST-태그 WCA 도메인(GST-VCA)은 강력하고 지속적인 핵 생성 활성을 제공하며, GST 이량체화는 이러한 활성을 더욱 향상시킵니다63. 비드 코팅 전에 pyrene-actin 중합 분석법을 사용하여 모든 NPF 구성물의 활성을 검증할 것을 권장합니다. 상용 GST-VCA의 활성을 참조 표준으로 사용할 수 있습니다. 특히, 여기서 사용된 상용 GST-VCA는 polyproline 영역이 없어 profilin–actin 복합체와 상호작용하지 않습니다26. 셋째, 꼬리 성장의 신뢰성 있는 시각화를 위해서는 슬라이드와 커버슬립의 세심한 준비가 필요합니다. 슬라이드와 커버슬립을 물과 에탄올로 철저히 세척한 후, 사용 직전에 플라스마 세척을 수행할 것을 권장합니다. 가능하다면 비특이적 단백질 흡착을 최소화하고 재현성을 높여주는 polyethylene glycol–silanized 커버슬립26을 사용하는 것이 좋습니다. 이동성 혼합액에 적절한 농도의 BSA를 포함하면 비특이적 표면 상호작용을 더욱 줄이고 일관된 분석 성능을 촉진할 수 있습니다. 넷째, 챔버에 투입하는 시료의 부피는 신뢰할 수 있는 측정에 매우 중요합니다15,16,17. 시료 부피가 너무 많으면 비드가 표류하여 꼬리 신장을 정확하게 추적할 수 없습니다. 반대로 시료 부피가 부족하면 슬라이드와 커버슬립 사이에 비드가 압착되어 마찰이 증가하고 비드가 고정됩니다. 이러한 기계적 제약은 꼬리의 형태를 왜곡하고 측정된 성장 역학을 변화시킬 수 있습니다. 따라서 재현성 있는 결과를 얻기 위해서는 챔버 높이와 시료 부피를 모두 최적화하는 것이 필수적입니다. 각 실험 설정에 맞게 시료 부피를 경험적으로 최적화할 것을 권장합니다. 본 설명과 같이 22 mm × 22 mm 커버슬립을 사용할 때, 2.1–2.3 µL의 이동성 혼합액을 투입하면 챔버 높이가 약 4.3 µm가 되어, 과도한 표류나 압착 없이 2.0-µm-diameter 비드가 안정적으로 배치됩니다.&#160;다른 크기의 커버슬립을 사용하는 경우, 균일한 챔버 채움, 안정적인 비드 배치 및 최소한의 시료 표류를 달성하기 위해 시료 부피를 그에 맞게 조정해야 합니다.
코멧 꼬리(comet tails)가 형성되지 않는 경우, 액틴 중합 능력과 NPF 활성을 확인하십시오. 대칭 붕괴가 일어나지 않는 경우, CP 농도를 조절하여 네트워크 밀도를 조정하십시오. 네트워크 밀도가 지나치게 높으면 파괴에 저항하며, 너무 낮으면 구조적 무결성이 부족해집니다. 마이오신 코팅 비드가 대조군 비드와 차이가 없는 경우, 마이오신의 표면 밀도와 모터 활성을 확인하십시오. 품질 관리를 위한 수락 기준은 절대적인 수치 컷오프가 아닌 기능적 기준을 따릅니다. 다음과 같은 경우 새로운 조제물이 적합한 것으로 간주합니다.&#160;이는 이전에 검증된 조제물에서 관찰된 혜성 꼬리 형성 및 성장을 재현합니다(다음에 나타난 바와 같이).&#160;그림 3). 또한, 마이오신(myosin), Arp2/3 복합체, NPF, CapZ 또는 액틴(actin)의 각 새로운 제제는 사용 전 적절한 품질 관리 분석법을 통해 평가되어야 하며, 정량적 실험 전반의 일관성을 보장하기 위해 이전에 검증된 제제와 비교되어야 합니다(참조 프로토콜 섹션 3.1).
결과를 해석할 때 이 분석법의 몇 가지 제한 사항을 고려해야 합니다. 첫째, 형광 강도는 액틴 네트워크 밀도를 나타내는 상대적이고 보정되지 않은 대리 지표로 사용됩니다. 따라서 동일한 획득 설정으로 이미징하고 동일한 임계값 설정 워크플로우를 사용하여 분석한 샘플 간에만 비교를 수행해야 합니다. 둘째, 비드 운동성, 코멧 꼬리(comet-tail) 성장 및 성장 효율은 힘을 생성하는 네트워크 동작에 대한 간접적인 판독값을 제공하지만, 힘의 직접적인 측정값은 아닙니다. 네트워크에 의해 생성되는 힘을 정량화하려면 광학 트래핑(optical trapping)이나 힘-보정된 막 변형 분석64,65과 같은 직접적인 기계적 측정이 필요합니다. 셋째, 이 분석법은 필라멘트 방향, 분지 밀도 또는 국소 마이오신(myosin) 구성과 같은 액틴 네트워크의 초미세 구조를 직접적으로 분해하지 못합니다.&#160;나노스케일 구조&#160;특성 분석을 위해서는 전자 현미경이나 초고해상도 이미징과 같은 상보적인 접근 방식이 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 강성인 마이크론 크기의 비드를 사용하는 것은 단순하고 실험적으로 다루기 쉬운 인터페이스를 제공하지만, 세포막의 변형 가능성, 곡률의 불균질성, 지질 유동성 또는 분자적 복잡성을 모두 포착하지는 못합니다. 따라서 세포 선단부(leading edge)에서 세포골격 성분들이 어떻게 협동하는지 조사하기 위해서는 생리학적으로 더 관련성 높은 인터페이스의 향후 개발이 중요할 것입니다.
전반적으로, 이러한 재구성 접근 방식은 단백질 조성과 농도를 정밀하게 제어할 수 있게 하여, 세포 시스템에서는 달성하기 어려운 방식으로 개별 구성 요소들을 기계론적으로 분석할 수 있게 합니다. 이는 분자 모터가 분지형 액틴 네트워크를 어떻게 재구성하고 막 유사 인터페이스에서 힘 생성을 어떻게 형성하는지 연구하기 위한 다각적인 플랫폼을 제공합니다. 적절한 검증을 거치면, 이 분석법은 서로 다른 마이오신 클래스, 돌연변이 또는 질환 관련 모터 변이체, 그리고 힘-민감성 액틴 결합 단백질이 동적인 액틴 네트워크 내에서 기계적 피드백을 어떻게 조절하는지 조사하는 데까지 확장될 수 있습니다. 더 넓게는, 이 시스템은 분자 규모의 모터 활성을 중간 규모의 세포골격 구조 및 기계적 기능과 연결하는 데 도움을 주며, 이는 세포 이동성, 내세포작용 및 막 재구성에 시사하는 바가 큽니다.

actin-related protein 2/3 (Arp2/3) 복합체에 의해 매개되는 분지형 액틴 중합은 세포 이동, 내포 작용, 식세포 작용 및 세포 접착 복합체 형성을 포함한 다양한 세포 과정의 핵심 동력이 되는 일차적인 돌출력을 생성합니다1,2,3,4,5,6. 이동하는 세포의 선단부에서 핵형성 촉진 인자(nucleation-promoting factors, NPFs)는 세포막에서 Arp2/3 복합체를 활성화하여 막을 앞으로 밀어내는 수지상 액틴 네트워크 조립을 시작합니다. Myosin-I 모터는 막 계면의 이러한 분지형 액틴 네트워크와 빈번하게 공국소화되며, &#160;액틴 구조&#160;조절 및 힘 생성 변조에 관여하는 것으로 알려져 있습니다7,8,9,10,11,12,13. Myosin-I이 액틴 의존적 기계적 과정에 기여한다는 증거가 축적되고 있음에도 불구하고, Myosin-I이 Arp2/3 매개 분지형 액틴 조립과 상호작용하여 네트워크 구조와 기계적 출력을 조절하는 분자적 기제는 여전히 충분히 밝혀지지 않았습니다.
이러한 공백을 메우기 위해, 우리는 마이크론 크기 비드 표면에서 myosin-I, actin 및 Arp2/3 complex 간의 상호작용을 재구성하고자, 잘 확립된 actin comet-tail 비드 운동성 시스템14,15,16,17에 myosin-I를 통합하였습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 막과 유사한 계면에서 myosin-actin 결합이 분지형 actin 조립, 네트워크 구조, 대칭성 붕괴 및 비드 운동성에 어떻게 영향을 미치는지 정량적으로 조사하는 것입니다. 이 분석법에서는--plasma membrane에서의 공동 국소화를 모방하기 위해 myosin-I와 NPF를 마이크로 스케일 비드에 함께 코팅합니다18. 중합이 시작되면, 표면에 결합된 NPF가 Arp2/3 의존적 분지형 actin 조립을 촉진하여, actin-shell 형성, 대칭성 붕괴 및 비드 추진을 유도하는 편향된 comet tail의 발달로 이어집니다&#160;14,19,20,21,22,23. myosin 표면 밀도를 체계적으로 변화시키고18 capping protein (CP) 농도를 통해 actin 네트워크 밀도를 조절함으로써15,19,24, 이 방법은 actin 조립 역학, 성장 효율, 네트워크 구조 및 비드 운동성을 정량적으로 분석할 수 있게 하며, myosin-I 의존적인 기계적 출력 변화와 관련된 간접적인 판독값을 제공합니다.
이 분석법은 상보적인 접근 방식들에 비해 뚜렷한 장점을 제공합니다. 피렌-액틴 분석법(pyrene-actin assays)과 같은 벌크 중합 분석법과 비교하여, 이 비드 운동성 시스템은 분지형 액틴 조립과 액틴 중합으로 유도되는 비드의 움직임을 직접적으로 시각화할 수 있게 합니다. 단백질 기능의 중첩과 복잡한 세포 환경으로 인해 개별 기여도를 파악하기 어렵고 해석이 복잡해질 수 있는 세포 연구와는 대조적으로, 이 분석법은 단백질 조성, 농도 및 표면 구성을 정밀하게 제어할 수 있어, 정의된 생화학적 조건 하에서 myosin-I이 Arp2/3 매개 액틴 조립과 어떻게 상호작용하는지를 체계적으로 조사할 수 있게 합니다.
이 방법은 세포골격 성분들이 막 유사&#160;계면에서 어떻게 협력하여 액틴 네트워크 구조와 기계적 출력을 조절하는지 연구하는 데 가장 적합합니다. 현재 프로토콜은 myosin-I 매개 분지 액틴 조립에 최적화되어 있지만, 그 모듈형 설계 덕분에 향후 다른 막 관련 마이오신 클래스(예: myosin VI, VII, X, XV 및 XIX) 및/또는 액틴 결합 단백질(예: formins, vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP), cortactin, coronin 또는 tropomyosin)을 조사하는 데 응용될 수 있습니다. 이러한 응용을 위해서는 단백질의 고정, 활성 및 표면 밀도에 대한 검증이 필요합니다. 또한, 이 분석법은 펄스-체이스 표지 전략에 적용 가능합니다. 광전환 또는 광활성 액틴, 혹은 표지된 Arp2/3 하위 단위체를 도입하면 성장하는 네트워크 내에서 필라멘트의 턴오버 및 분지 해리 속도를 측정할 수 있을 것입니다25. 전반적으로, 이 분석법은 막 관련 모터, 액틴 필라멘트 및 액틴 결합 단백질 간의 분자적 상호작용을 조사하고, 모터와 액틴 결합 단백질이 막 유사 계면에서 네트워크 리모델링과 힘 생성을 어떻게 조절하는지 탐구할 수 있는 다목적 플랫폼을 제공합니다14,15,26,27,28,29,30,31,32,33,34. 더 넓게는, 대칭성 붕괴, 자기 조직화, 기계화학적 피드백 및 활성 액토마이오신 네트워크의 기타 창발적 행동과 같이 모터에 의해 구동되는 비평형 역학의 물리적 원리를 조사하기 위한 최소한의 조정 가능한 활성 물질 플랫폼 역할을 하며, 이는 활성 물질 물리학 및 재료 공학 분야와도 관련될 가능성이 있습니다18,19,20,21,22,23,35,36.

<table><tbody><tr><td>아데노신 5'-삼인산 (Adenosine 5'-triphosphate)&amp;prime;-삼인산 이나트륨염 수화물</td><td>시그마</td><td>A26209</td><td>ATP 함유 완충액 조제에 사용하며, 소분하여 다음 조건에서 보관하십시오. &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Arp2/3 복합체</td><td>자체 제작됨</td><td>제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.</td><td>분지형 액틴 네트워크의 핵형성을 위해 사용됨; 문헌 42에 따라 정제됨.</td></tr><tr><td>Biotin-CF640 형광 염료</td><td>Biotium</td><td>80032</td><td>대조군 비드의 형광 표지에 사용함; 차광하여 다음 온도에서 보관할 것 &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>비오틴화된 Myo1d</td><td>자체 제작됨</td><td>제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.</td><td>myosin이 코팅된 비드에 부착하는 데 사용된 모터 단백질; 문헌 18 및 38에 기술된 방법으로 준비함&amp;ndash;40.</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A7906</td><td>비드 블로킹 및 비드 보관 버퍼로 사용하며, 필터링된 스톡 솔루션을 준비하십시오.</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마</td><td>C7902</td><td>X 버퍼 및 칼슘 파괴 실험에 사용된 버퍼 성분.</td></tr><tr><td>칼모듈린</td><td>자체 제작</td><td>제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.</td><td>myosin 함유 반응액 및 비드 보관 버퍼에 첨가됨; 문헌 44에 따라 정제됨.</td></tr><tr><td>카복실화 폴리스티렌 비드 (2.0 &amp;micro;m 지름)</td><td>Polysciences</td><td>18327-10</td><td>NPF, NeutrAvidin, 형광 염료 및 미오신 코팅을 위한 고체 지지체로 사용하며, 다음 조건에서 보관하십시오. 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Teledyne</td><td>01-RET-R6-R-M-14-C-OC</td><td>타임랩스 현미경 관찰 중 형광 이미지 획득에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue 염색</td><td>시그마</td><td>B7920</td><td>밀도 분석(densitometric analysis) 전 SDS-PAGE 겔을 염색하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>커버슬립, 22 mm &amp;times; 22 mm, #1.5</td><td>글로브</td><td>1404-15</td><td>현미경 슬라이드와 함께 사용하여 압착 챔버(squeeze chamber)를 구성하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>디티오트레이톨 (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>완충액 및 운동성 혼합물에 사용되는 환원제; 보관 온도 &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>건식 스크롤 진공 펌프</td><td>Agilent Technologies</td><td>IDP3B01</td><td>플라스마 세척 시스템을 작동하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>GoldBio</td><td>E-217-100</td><td>M 버퍼, 운동성 버퍼 및 액틴 전처리에 사용되는 칼슘 킬레이트제.</td></tr><tr><td>외부 광원</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>형광 현미경용 금속 할라이드 광원.</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>오픈 소스</td><td>제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.</td><td>코멧 꼬리 길이, 형광 강도 및 네트워크 밀도 분석에 사용됨 (버전 2.16.0/1.54p).</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Leica</td><td>DMIRB</td><td>액틴 꼬리(actin comet tails) 영상을 촬영하는 데 사용된 도립 에피형광 현미경.</td></tr><tr><td>빙초산</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP2401-212</td><td>SDS-PAGE 겔 탈색 용액의 성분; 부식성 물질이므로 적절한 주의 사항을 준수하여 취급하십시오.</td></tr><tr><td>GST-VCA</td><td>세포골격</td><td>VCG03-A</td><td>Arp2/3 매개 액틴 조립에 사용되는 핵형성 촉진 인자; 소분하여 다음 온도에서 보관하십시오. &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GoldBio</td><td>H-400-1</td><td>X 버퍼, M 버퍼 및 운동성 버퍼(motility buffer)에 사용되는 완충제.</td></tr><tr><td>인간 CapZ</td><td>자체 제작함</td><td>제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.</td><td>액틴 네트워크 밀도를 조절하는 데 사용된 캡핑 단백질(Capping protein); 문헌 43에 따라 정제함.</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Spectrum Chemical</td><td>M1035</td><td>반응 버퍼 및 액틴 전처리에 사용되는 버퍼 성분.</td></tr><tr><td>MetaMorph 이미징 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td>제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주시기 바랍니다.</td><td>현미경 제어 및 이미지 획득에 사용되었습니다 (버전 7.10.4.459).</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마</td><td>MX0485-3</td><td>SDS-PAGE 겔 탈색 용액의 성분; 가연성 물질이므로 기관의 안전 절차에 따라 취급하십시오.</td></tr><tr><td>메틸셀룰로오스</td><td>시그마</td><td>M0387</td><td>용액의 점도(1500 cP)를 높이기 위해 운동성 완충액(motility buffer)에 첨가됨.</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Corning</td><td>2947-75X25</td><td>현미경 관찰용 스퀴즈 챔버(squeeze chamber) 조립에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>NeutrAvidin 단백질</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>비오틴화된 단백질을 비드 표면에 고정하는 데 사용됩니다. 소분하여 다음 조건에서 보관하십시오. &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619</td><td>SDS-PAGE 분석에 사용되는 분자량 마커; 보관 온도: &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>플라즈마 세척기</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>챔버 조립 전 현미경 슬라이드와 커버글라스를 플라스마 세척하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>폴리에테르설폰 시린지 필터, 0.22 &amp;micro;m</td><td>시그마</td><td>SLGPR33RS</td><td>분주 전 소혈청알부민(bovine serum albumin) 스톡 용액을 여과하는 데 사용됨.</td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-1</td><td>분석 버퍼의 이온 강도를 유지하는 데 사용되는 염.</td></tr><tr><td>토끼 골격근 액틴</td><td>자체 제작됨</td><td>제시된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주시기 바랍니다.</td><td>참고문헌 41에 따라 정제하였으며, 액틴 꼬리 조립 분석(actin comet-tail assembly assays)을 위한 G-actin으로 사용하였다.</td></tr><tr><td>냉장 마이크로원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td>비드 준비 및 세척 단계에서 비드 침전물(pellet)을 형성하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>회전 튜브 믹서 (벤치탑 로테이터)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-04397-40</td><td>비드 현탁액 상태를 유지하기 위해 비드 코팅 배양 중에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Tris/Glycine/SDS 전기영동 버퍼 (10&amp;times;)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>1로 희석하십시오.&amp;times; SDS-PAGE 전기영동 전.</td></tr><tr><td>진공 그리스</td><td>고진공 장비 보관소</td><td>408524</td><td>형광 이미징 전 스퀴즈 챔버를 밀봉하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>4%&amp;ndash;20% 구배 SDS-폴리아크릴아마이드 겔</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>비드 결합 단백질의 SDS-PAGE 분석에 사용됨; 보관 온도: 4&amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

비드 기반 액틴 코멧 꼬리 운동성 분석법을 이용한 마이오신-i 매개 분지 액틴 조립의 재구성

Reconstituting Myosin-I-Mediated Branched Actin Assembly in a Bead-Based Actin Comet-Tail Motility Assay

actin-related protein 2/3 (Arp2/3) 복합체에 의해 매개되는 분지형 액틴 중합은 세포 이동, 내세포작용(endocytosis) 및 식세포작용(phagocytosis)을 포함한 다양한 세포 과정에 주요한 추진력을 제공합니다. 세포 전단부(leading edge)의 분지형 액틴 네트워크와 자주 공국소화(colocalize)되는 Myosin-I 모터 또한 이러한 과정에 참여하는 것으로 나타났으며, 액틴 네트워크의 조직화와 기계적 출력을 조절하는 것으로 생각됩니다. 하지만, myosin-I가 Arp2/3 복합체와 상호작용하여 분지형 액틴 조립과 힘 생성을 조절하는 분자적 메커니즘은 여전히 상당 부분 알려지지 않은 상태입니다. 본 연구에서는 마이크론 크기의 비드 표면에서 세포 전단부의 myosin-I, 액틴 및 Arp2/3 복합체 간의 상호작용을 재구성하는, 정밀하게 조절 가능한 in vitro 액틴 코멧-테일 비드 운동성 분석법(actin comet-tail bead motility assay)을 설명합니다. 이 방법은 비드 표면에 myosin-I와 핵 형성 촉진 인자(NPFs)를 함께 고정하여 막과 유사한 액틴 조립 인터페이스를 생성함으로써, 잘 확립된 액틴 코멧-테일 분석법을 응용한 것입니다. 이 분석법을 통해 액틴 네트워크 조립, 네트워크 밀도, 비드 운동성 및 성장 효율을 시각화하고 정량적으로 분석할 수 있습니다. 또한, 분지형 액틴 네트워크에서 myosin-I에 의해 매개되는 힘의 증강을 간접적으로 정성 분석할 수 있는 리드아웃을 제공합니다. 본 프로토콜은 비드 기능화, 반응 조립, 형광 이미징, 정량적 이미지 분석 및 문제 해결 전략을 포함하며, 막과 유사한 인터페이스에서 myosin-I가 조절하는 액틴 조립을 연구하기 위한 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다.

세포 선단부(cell leading edge)에서 Arp2/3 복합체 매개 가지형 액틴 조립에 미치는 myosin-I 활성의 영향을 조사하기 위해 액틴 혜성-꼬리 비드 운동성 분석(actin comet-tail bead motility assay)이 사용되었으며, 이는 막 결합 myosin-I이 액틴 중합과 협력하여 막 돌출을 유도하는 시나리오를 재현한 것입니다7,8,9,10,11,12,13. 막-액틴 계면에서 myosin-I과 NPF의 공동 국소화를 모사하기 위해, 두 단백질을 마이크로 규모 비드 표면에 공동 코팅하여 조절된 in vitro 시스템에서 이들의 공간적 근접성을 재구성하였습니다(그림 1A,B).
<img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig1.jpg" /> 
그림 1마이크로 스케일 비드 상에서의 myosin-I 매개 분지형 액틴 조립의 재구성. (A) 세포 전면부(leading edge)에서 myosin-I, 핵 형성 촉진 인자(NPFs), actin-related protein 2/3 (Arp2/3) 복합체, 캡핑 단백질(CP) 및 구상 액틴(G-actin) 간의 상호작용을 보여주는 모식도. (B) 비드 기능화 모식도. 대조군 비드와 미오신 코팅 비드는 NPF 및 뉴트라비딘(neutravidin)으로 코팅되었다. 뉴트라비딘은 대조군 비드의 경우 비오틴화된 원적외선 형광 염료에, 또는 비오틴화된 초파리 마이오신 코팅 비드를 위한 Myo1d.C) 대조군 비드와 미오신이 코팅된 비드에서 대칭 붕괴부터 극성 혜성 꼬리 형성까지의 액틴 혜성 꼬리 성장을 보여주는 대표적 시계열 이미지. 마지막 패널은 동일한 시야 내의 두 비드를 보여준다. 스케일 바, 5 &#181;m패널 B와 C는 Xu 등의 연구에서 재현/수정되었습니다. 사이언스 어드밴시스(Science Advances), DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, 허가 하에 사용. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
액틴 조립에 대한 myosin-I의 특정한 기여도를 더 정확하게 평가하기 위해, 이에 대응하는 대조군 비드를 함께 제작하였다. 대조군 비드는 myosin-I 대신 neutravidin이 접합된 biotinylated far-red 형광 염료를 사용했다는 점을 제외하고는 myosin이 코팅된 비드와 동일하였다(그림 1B). 두 종류의 비드를 동일한 반응 챔버 내에서 혼합하고 동일한 시야에서 이미징함으로써, 동일한 실험 조건 하에서 myosin-I의 존재 및 부재 시 가지형 액틴 조립을 직접적으로 비교할 수 있었다(그림 1C). 또한, 비드 표면의 myosin 대 NPF 비율을 변화시킴으로써, 서로 다른 표면 밀도에 따른 myosin-I의 효과를 체계적으로 조사할 수 있었다(그림 2A,B). 아울러, CP의 농도를 조절하여 액틴 네트워크 밀도를 조정함으로써, 조밀하게 채워져 대칭 붕괴에 저항하는 구조부터 느슨하게 구성되어 파손되기 쉬운 구조까지 다양한 네트워크를 생성하였다15,19,24. 이러한 접근 방식을 통해 밀도와 구조적 무결성이 서로 다른 네트워크 전반에서 myosin-I가 가지형 액틴 조립에 어떻게 영향을 미치는지 연구할 수 있었다(그림 2A,B).
<img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig2.jpg" /> 
그림 2. 액틴 혜성-꼬리 형태(Actin comet-tail morphology)&#160;마이오신 표면 밀도 및 캡핑 단백질 농도 전반에 걸쳐. (A) 2-의 대표 형광 이미지&#181;m서로 다른 마이오신 표면 밀도로 코팅되고 30~200 nM의 캡핑 단백질(CP)이 포함된 반응액에서 조립된 직경의 비드, 4 &#181;M 5% 로다민 표지 액틴과 200 nM Arp2/3가 포함된 액틴&#160;복합체. 각 조건에 대해, 대조군 비드와 미오신 코팅 비드를 동일한 시야에서 촬영하였다. 미오신 및 핵 형성 촉진 인자(NPF)의 표면 밀도는 단계 2.3에서 설명한 대로 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통해 결정하였다. 이미지는 반응 시작 후 20~35분 후에 획득하였다. 밝기와 대비는 각 대조군-미오신 비드 쌍 내에서 선형적으로 동일하게 조정되었으나, 시각화를 위해 조건 간에는 독립적으로 스케일을 조정하였다. 스케일 바, 5 &#181;m. (B) CP 농도 및 myosin 표면 밀도에 따른 comet-tail 결과물을 요약한 정성적 분석 맵. 각 데이터 포인트는 표시된 조건 하에서의 대조군-myosin 비드 쌍을 나타낸다. 기호는 대칭 붕괴를 촉진하는 myosin 코팅 비드, 더 긴 꼬리, 유사한 꼬리, 더 짧은 꼬리, comet-tail 미형성 또는 aster 유사 구조를 포함하여 관찰된 결과물을 나타낸다. 데이터는 20회 이상의 독립적인 실험에서 수집되었으며, 각 조건당 10쌍 이상의 비드 쌍을 분석하였다. 이 그림은 Xu et al.에서 재현/수정되었다. Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, 허가 하에 사용. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
분석 성분들을 혼합하면, 표면에 결합된 NPFs가 비드 표면 주변에서 Arp2/3 복합체 매개 분지형 액틴 조립을 촉진했습니다. 전형적인 성공적인 반응에서는 액틴이 먼저 비드를 둘러싸는 희소한 껍질(shell) 형태로 나타났습니다. 중합이 진행됨에 따라 껍질이 확장되었고 네트워크는 더 조밀하게 얽히게 되었습니다. 비드 표면에서 액틴 조립이 지속되면서 네트워크의 외부 성장이 유도되었으며, 이는 대칭성 붕괴와 극성 혜성 꼬리(comet tail)의 형성으로 이어질 수 있었습니다. 혜성 꼬리가 형성되면, 비드 표면에서 지속적인 액틴 핵 형성 및 중합이 일어나 비드의 지속적인 이동을 뒷받침했습니다(그림 1C). 이러한 액틴 껍질 형성, 대칭성 붕괴, 혜성 꼬리 확장 및 비드 추진으로 이어지는 순차적 특징들은 분석이 적절하게 작동하고 있음을 보여주는 시각적 지표가 되었습니다.
당사의 기존 연구18에서 보고하고 그림 2A,B에서 보여준 바와 같이, 코멧 꼬리(comet-tail) 형태는 CP 농도와 미오신 표면 밀도 모두에 민감하게 반응했습니다. 표준 분석 조건(200 nM Arp2/3 complex, 50 nM CP, myosin:NPF 비율 = 0.43:1)에서 미오신이 코팅된 비드는 일반적으로 대조군 비드보다 더 희소하거나 확산된 액틴 코멧 꼬리를 형성했습니다(그림 2A). 낮은 CP 농도(&lt;30 nM)에서는 액틴이 조밀하고 파손에 강한 껍질 형태로 조립되었습니다. 이러한 조건에서 대조군 비드는 종종 캡슐화된 상태로 남아 대칭 붕괴(symmetry breaking)가 일어나지 않은 반면, 미오신 코팅 비드는 대칭을 붕괴시키고 주변 액틴 껍질에서 탈출할 가능성이 더 높았습니다(그림 2A,B). 높은 CP 농도(&gt;200 nM)에서는 네트워크 응집력이 감소했으며, 미오신의 존재는 액틴 네트워크를 더욱 불안정하게 만들어 액틴 탈락(shedding)을 촉진하고 안정적인 코멧 꼬리의 형성을 방해했습니다(그림 2A,B). 이러한 조건 의존적 결과는 연구자가 적절한 분석 체계를 식별하고 분석 성능의 문제를 해결하는 데 사용할 수 있는 유용한 기준을 제공합니다.
액틴 코멧 꼬리(comet-tail) 형태에 미치는 myosin-I의 영향은 꼬리의 평균 형광 강도를 측정하여 평가할 수 있습니다. 단계 4.2에서 설명한 대로 강도 임계값을 사용하여 코멧 꼬리 영역을 정의한 다음, 이 영역 내의 평균 형광 강도를 측정하였습니다(그림 3A). 대조군 및 myosin 코팅 비드를 동일한 시야에서 촬영한 동일 이미지 조건 하에서, 이 값은 액틴 네트워크 밀도를 나타내는 상대적이고 보정되지 않은 대리 지표로 사용되었으며, 평균 강도가 낮을수록 네트워크가 더 희소함을 나타냅니다. 표준 분석 조건에서 myosin 코팅 비드는 일반적으로 대조군 비드보다 평균 형광 강도가 낮은 코멧 꼬리를 생성하였으며, 이는 겉보기 네트워크 밀도가 감소한 것과 일치합니다(그림 3C).
<img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig3.jpg" /> 
그림 3액틴 코멧-테일(comet-tail) 성장 kinetics 및 조립 효율의 정량화 워크플로. (A) 50 nM capping protein(CP) 존재 하에서 대조군 비드와 0.43:1 마이오신 코팅 비드의 코멧 꼬리 성장을 나타내는 대표적 시계열 이미지. 검은색 외곽선은 형광 강도 측정을 위해 Fiji를 사용하여 설정한 코멧 꼬리 관심 영역(ROI)을 나타냄. 반응 조건: 4 &#181;M 5% 로다민 표지 액틴이 포함된 액틴, 200 nM 액틴 관련 단백질 2/3 (Arp2/3) 복합체 및 50 nM CP. 스케일 바, 5 &#181;m. (B(A) 패널에 표시된 대표적인 대조군-미오신 비드 쌍에 대해 시간에 따른 혜성 꼬리 길이를 도식화한 그래프. 삽입도는 선형 회귀 분석에 사용된 시간 범위를 보여주며, 꼬리 성장률은 적합된 직선의 기울기로부터 결정되었다.C) 패널 (A)에 제시된 대표적인 대조군-미오신 비드 쌍에 대해 시간에 따른 정규화된 총 꼬리 형광 강도를 도식화한 그래프이다. 대조군 및 미오신 비드는 1100초에서 1300초 사이의 대조군 비드 평균 형광 강도로 정규화되었다. 삽입도는 선형 피팅에 사용된 시간 범위를 나타내며, 형광 조립 속도는 피팅된 직선의 기울기로부터 계산되었다. (D(A) 패널에 표시된 대표적인 대조군-마이오신 비드 쌍의 꼬리 성장률, 형광 조립 속도 및 성장 효율을 나타낸 요약 표. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
comet-tail 성장 역학에 미치는 myosin-I의 효과는 시간에 따른 comet-tail 신장과 actin 형광 축적을 모두 측정하여 정량화할 수 있다. 대부분의 실험에서 comet tail은 대칭성 붕괴 후 처음 ~10분 동안 거의 일정한 속도로 성장했다. 중합 성분이 고갈됨에 따라 신장 속도는 점차 느려졌으며, 일반적으로 반응 시작 후 약 30분 뒤에 정지했다. 성장 역학을 정량화하기 위해 comet-tail 길이와 총 형광 강도를 시간의 함수로 도식화했다(Figure 3B,C). 초기 선형 단계에 해당하는 처음 7–10개의 데이터 포인트는 선형 회귀를 사용하여 피팅했다(Figure 3B,C, 삽입도). 이 피팅의 기울기는 각각 초기 tail 성장 속도와 actin 형광 조립 속도를 나타낸다. 성장 효율은 comet-tail 성장 속도를 actin 형광 조립 속도로 나눈 값으로 정의하며, 이는 actin 중합이 생산적인 비드 변위로 얼마나 효과적으로 전환되었는지를 정량화한 것이다(Figure 3D). Figure 3A–D에 제시된 대표적인 예에서 myosin이 코팅된 비드는 0.60 µm/min (0.010 µm/s)의 tail 성장 속도를 보였으며, 이는 대조군 비드의 0.57 µm/min (0.0095 µm/s)과 대비된다(Figure 3B,D). 이에 해당하는 성장 효율은 각각 5.6 및 4.5 µm/intensity unit였으며, myosin 코팅 비드가 약 1.2배 더 높은 값을 나타냈다(Figure 3D). 표준 조건에서 myosin 코팅 비드는 일반적으로 대조군 비드와 유사한 성장 속도를 보였으며(myosin: 0.69 ± 0.10 µm/min; control: 0.66 ± 0.20 µm/min), 더 낮은 actin 형광 조립 속도(대조군의 약 0.76배)와 약 1.4배 더 높은 성장 효율을 보였는데, 이는 이전의 원본 연구18에서 보고된 바와 같다. 이 값들은 5회의 독립적인 실험을 통해 조건당 11쌍의 비드로부터 얻은 평균 ± SD로 보고되었다. 통계 분석은 원본 연구18에 기술된 대로 양측 paired t-test를 사용하여 수행되었다.
마이오신 파워 스트로크(power stroke)의 기여도를 평가하고 관찰된 효과가 마이오신 표면 점유로 인한 입체 장애(steric hindrance)에서 비롯되었을 가능성을 배제하기 위해, 마이오신-I 파워 스트로크 활성을 저해하는 조건에서 비드 운동성 분석(bead motility assay)을 수행할 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 반응 혼합물에 1.1 mM Ca2+를 첨가하여 마이오신-I 모터 활성을 억제하였습니다. 상승된 Ca2+ 농도는 마이오신-I 레버 암(lever arm)에서 칼모듈린(calmodulin)의 해리를 촉진하여 레버 암의 강성을 감소시키고 힘 생성 능력을 저하시켰습니다46,47,48. 이러한 조건에서 마이오신-I는 액틴과 동적으로 결합된 상태를 유지했으나 액틴 글라이딩(actin gliding)은 지원하지 않았으며(그림 4A,B), 이는 모터 활성 의존적 효과를 평가하기 위한 유용한 대조군이 됩니다18.
<img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig4.jpg" /> 
그림 4비드 운동성 분석에서 Myo1d 모터 활성을 평가하기 위한 칼슘 기반 대조군. (A) 칼슘 농도가 높지 않을 때 Myo1d가 코팅된 표면 위에서 이동하는 액틴 필라멘트와, 칼슘 농도가 높을 때 비생산적인 소용돌이 패턴을 형성하는 액틴 필라멘트의 시간 압축 이미지 100 &#181;M 유리 칼슘. 무지개색 컬러바는 5초 간격으로 획득한 61프레임 동안의 시간 경과를 나타냅니다. 스케일 바, 5 &#181;m. (B) actin gliding 속도의 정량화: [물질명] 부재 시 및 존재 시 100 &#181;M 유리 칼슘 (N = 2회 독립 실험; n = 25개 필라멘트). ~가 존재할 때는 생산적인 액틴 글라이딩이 관찰되지 않았다. 100 &#181;M 이 조건에서의 유리 칼슘. 오차 막대는 표준편차(SD)를 나타냄. (C) ~의 존재 하 또는 부재 하에 조립된 대표적인 대조군 및 미오신 코팅 비드 쌍 100 &#181;M 유리 칼슘. 각 조건에 대해 5개의 대표적인 비드 쌍을 보여준다. 각 쌍 내에서 대조군 비드와 미오신 코팅 비드를 동일한 시야에서 촬영하였다. 이미지는 반응 시작 후 약 15~20분 후에 획득하였다. 밝기와 대비는 각 대조군-미오신 비드 쌍 내에서 선형적으로 동일하게 조정되었으나, 조건 간에는 독립적으로 조정되었다. 반응 조건: 4 &#181;M 5% 로다민 표지 액틴이 포함된 액틴, 200 nM 액틴 관련 단백질 2/3 (Arp2/3) 복합체 및 50 nM 캡핑 단백질 (CP). 스케일 바, 5 &#181;m패널 A와 B는 Xu 등의 문헌에서 재현/수정되었습니다. 사이언스 어드밴시스(Science Advances), DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, 허가 하에 사용됨. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
분석이 정확하게 수행되었을 때, 고농도 Ca2+ 조건에서 분석된 myosin 코팅 비드는 대조군 비드와 유사한 네트워크 밀도를 가지면서 더 짧은 actin 코멧 꼬리를 형성하였다(그림 4C). 두 번의 독립적인 실험에서 얻은 다섯 쌍의 대표적인 대조군 및 myosin 코팅 비드가 제시되어 있다. 이러한 정성적 결과는 반복적인 분석 준비 과정에서 일관되게 관찰되었으며, 기존 연구18에서 보고된 정량적 분석에 의해 뒷받침된다. 이러한 예상 결과는 표준 조건에서 관찰된 네트워크 차이가 단순한 myosin 표면 점유도가 아니라 활성 myosin 파워 스트로크(power stroke)에 의존함을 나타낸다. 따라서 고농도 Ca2+ 조건은 분지형 actin 네트워크 조직의 변화가 myosin 모터 활성으로 인해 발생하는지 평가하는 핵심 대조군 역할을 한다.

본 프로토콜은 마이오신 모터 활성이 막 유사 인터페이스에서 분지형 액틴 조립 및 네트워크 구조에 어떠한 영향을 미치는지 정량적으로 조사하기 위한 조절 가능한 액틴 코멧-테일 비드 운동성 분석법을 설명합니다.

비드 기반 액틴 코멧 꼬리 운동성 분석법을 이용한 마이오신-I 매개 분지 액틴 조립의 재구성

액틴 관련 단백질 2/3(Arp2/3) 복합체에 의해 매개되는 분지형 액틴 중합은 다양한 세포 내...

Our research focuses on studying how myosin-I shapes branched actin networks and drives force generation at membrane interfaces. Previous cellular studies make it hard to isolate myosin-I effects. This protocol reconstitutes everything in vitro under well-controlled conditions.To begin, gather the required reagents. After preparing the nucleation-promoting factor, or NPF, and neutravidin coating mixture, gently mix the coating mixture by pipetting up and down 5 to 10 times, avoiding bubble formation. Transfer 5 microliters of bead slurry to a microcentrifuge tube. Add 10 microliters of X buffer to the beads and pipette at least five times. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant by tilting the tube and aspirating from the side opposite the bead pellet. Resuspend the washed beads in 50 microliters of the previously prepared coating mixture. Mix the suspension by gentle pipetting and leave a small air bubble to facilitate mixing during incubation. Incubate the beads on a benchtop rotator at 20 revolutions per minute for two hours at 4 degrees Celsius. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess neutravidin and GST-VCA. Resuspend the coated beads in 200 to 400 microliters of 10 milligrams per milliliter BSA. Incubate the suspension on ice for 30 minutes to block unoccupied binding sites on the bead surface. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant. Resuspend the beads in 50 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Remove the supernatant and repeat the wash twice. Store the coated beads in 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer on ice and use them within one week.To exchange the storage X buffer with the M buffer before myosin coating, divide 50 microliters of neutravidin-NPF-coated beads equally into two microcentrifuge tubes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius and carefully remove the supernatant. Wash the beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Resuspend the control beads in 25 microliters of 1 micromolar Biotin-CF640 fluorescent dye diluted from the stock solution in M buffer. Resuspend the myosin beads in 25 microliters of 500 nanomolar to 1 micromolar biotinylated myosin supplemented with 1 to 5 micromolar calmodulin. After covering the tubes with aluminum foil, incubate the bead suspensions on ice for at least 30 minutes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess biotinylated myosin or fluorescent dye. Wash the decorated beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Supplement the myosin-decorated beads with 1 to 5 micromolar calmodulin. Protect all decorated beads from light by covering the tubes with aluminum foil, then store the far-red fluorescent dye-decorated beads or myosin-decorated beads on ice.After bead preparation and decoration, prepare a 50-microliter motility mixture. Initiate the reaction by adding 4 microliters of 50 micromolar G-actin with 5% to 10% of the actin fluorescently labeled. Mix the reaction immediately and designate this time point as time equals 0. Clean the glass slide and coverslip with 70% ethanol, followed by deionized water. Plasma-clean the glass surfaces using ambient air plasma for 10 minutes. Apply 2.3 microliters of the reaction mixture to the glass slide. Place a 22-millimeter by 22-millimeter coverslip over the sample to form a squeeze chamber, with an approximate chamber height of 4.3 micrometers. Seal the chamber with vacuum grease. Using an epifluorescence microscope, acquire fluorescence images.Surface-bound NPFs stimulated branched actin assembly around the bead surface and actin first appeared as a sparse shell surrounding the bead. Continued actin assembly at the bead surface drove outward network growth, which led to symmetry breaking and the formation of a polarized comet tail. Once a comet tail was established, ongoing actin nucleation at the bead surface supported sustained bead movement. Under standard assay conditions, myosin-coated beads typically produce dimmer, sparser, or more diffuse actin comet tails than control beads.This protocol allows researchers to study how membrane-bound myosin motors regulate actin network density, growth kinetics, and polymerization-driven bead movement. The most important consideration is protein quality. Always validate new preparations against a previously validated batch before quantitative experiments. Future studies building on this work can test other membrane-associated myosins, disease-associated motor variants, or actin regulators at the membrane-like interface.

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Research

연구

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Bioengineering

생명공학

이 비디오에서는 액틴-미오신 상호작용을 분석하기 위해 체외 운동성 분석을 수행합니다. 고정된 미오신 분자에 대한 액틴 필라멘트의 활공 운동은 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

Inverted Motility Assay: An In Vitro technique to visualize myosin movement on immobilized actin filaments(반전 운동성 분석: 고정된 액틴 필라멘트에서 미오신 이동을 시각화하는 In vitro 기술)

여기에 제시된 미오신 5a를 발현하고 정화하는 절차이며, 체외 형광 현미경 기반 의 앙상블 과 단일 분자를 모두 사용하여 이러한 방법이 비근육 근신 2b의 특성화를 위해 어떻게 수정될 수 있는지에 대한 논의가 뒤따릅니다.

체외 형광 현미경 검사법 기반 운동성 검사의 Myosin 특이적 적응

여기에 제시된 것은 공정 myosin-5 모터에 대한 초고속 포스 클램프 실험을 수행하는 포괄적인 프로토콜이며, 이는 다른 등급의 공정 모터 연구로 쉽게 확장될 수 있습니다. 프로토콜은 실험 장치의 설정에서 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 필요한 모든 단계를 자세히 설명합니다.

초고속 포스 클램프 분광법을 사용한 공정 미오신의 기계적 효소 특성 해부

시험관 내에서 액토미오신 다발의 형성 및 광학 핀셋을 사용한 미오신 앙상블 힘 생성 측정이 제시되고 논의됩니다.

광학 핀셋을 사용하여 액틴 필라멘트 번들에서 미오신 앙상블 역학 조사

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

이 논문은 공동 얽힌 액틴 필라멘트와 미세 소관의 조정 가능한 3차원 복합 네트워크를 엔지니어링하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 복합 재료는 미오신 II 및 키네신 모터에 의해 구동되는 능동적 구조 조정 및 탄도 운동을 거치며 액틴, 미세 소관, 운동 단백질 및 수동 가교제의 상대적 농도에 의해 조정됩니다.

조정 가능한 모터 구동 역학 및 역학을 사용한 Actin-Microtubule 복합재 재구성 및 특성화

이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 단백질 성분을 사용하여 구슬 표면에 액틴 혜성을 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 시스템은 세포에서 발견되는 돌출 구조를 모방하고 단순화 된 방식으로 힘 생산의 생리적 메커니즘을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.

상업적으로 이용 가능한 단백질을 사용한 액틴 기반 운동성의 재구성

이 연구에서는 통제된 조건에서 악토미오신 겔의 다공성 탄성을 연구하기 위해 시험관 내 재구성 접근법을 사용합니다. 악토미오신 겔과 포매된 용매의 역학을 정량화하여 네트워크 다공탄성을 입증합니다. 또한 실험적 과제, 일반적인 함정 및 세포 골격 역학과의 관련성에 대해서도 논의합니다.

세포 세포 골격의 모델 시스템으로서의 (Poro-) 탄성 수축 Actomyosin 네트워크의 역학

여기에서는 정제된 단백질로부터 준2차원(2D) 얽힘, 가교 및 액정 액틴 어셈블리를 준비하는 방법을 제시합니다.

Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops (시험관 내 활성 활성 어셈블리의 수축성 및 변형 모드 조정: 2차원 활성 네트워크에서 액정 방울까지)

골드에 긴 사슬 alkane thiols의 형성에서 자기 조립 monolayers은 (샘스) 단백질 패턴 및 셀 감금의 형성을위한 잘 정의된 기판을 제공합니다. 와 backfilling 다음 polydimethylsiloxane (PDMS) 스탬프를 사용하여 hexadecanethiol의 Microcontact 인쇄 글리콜 - 종료 alkane thiol 모노머는 스탬프 hexadecanethiol 지역에 단백질과 세포 adsorb 패턴을 생산하고 있습니다.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

배우세요 비드 기반 액틴 코멧 꼬리 운동성 분석법을 이용하여 마이오신-I 매개 분지 액틴 조립을 재구성하고 정량적 분석하는 방법을 익히세요. 이 기법은 세포 골격 역학 연구에 활용됩니다.

비드 기반 액틴 코멧 꼬리 운동성 분석법을 이용한 마이오신-I 매개 분지 액틴 조립의 재구성

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