애기장대 뿌리의 핵 형태와 염색질 역학의 정량적 생세포 영상화 및 발달 및 환경 스트레스 중

우리 연구는 삼투압 스트레스로부터 장기적으로 뿌리 회복을 가능하게 하는 유전자와 메커니즘을 조사하여 가뭄에 대비해 작물을 강화합니다. 이 프로토콜은 애기장대 뿌리를 위해 개발되었지만, 형광 단백질 마커 계통을 가진 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이미지용 Arabidopsis thaliana 묘목이 담긴 성장판을 확보하세요.

순수 60마이크로리터를 유리 슬라이드에 피펫팅하세요. 6일 된 A. thaliana 묘목 뿌리 세 개를 물에 심으세요. 잎을 덮지 않고 뿌리 위에 22x22mm 크기의 1.5mm 커버를 놓으세요.

공초점 현미경 설정에서는 레이저 노출 시간을 1,000밀리초로 설정하세요. 레이저 결합기 설정에서 488나노미터 레이저를 50%로 설정해 녹색 형광 단백질(GFP) 영상을 촬영하세요. 561 나노미터 레이저를 50%로 설정해 적색 형광 단백질(RFP) 영상을 촬영하세요.

광학 줌 없이 20배 대물렌즈로 샘플을 촬영하세요. Z 슬라이스 스텝 크기를 0.3마이크로미터로 설정하세요. 영상 촬영 간격을 1분, 총 영상 시간을 10분으로 설정하세요.

루트를 찾아 최대 20개의 Z 슬라이스를 선택하세요. 16비트 이미지를 캡처하세요. 타임랩스 획득을 시작하고 무손실 압축을 사용해 타임랩스를 TIFF 파일로 저장하세요.

획득한 데이터를 컴퓨터로 옮겨 분석하세요. ImageJ 또는 Fiji 소프트웨어를 열어보세요. VSI 파일을 클릭해서 메인 ImageJ 또는 Fiji 애플리케이션 창으로 드래그하세요.

바이오 포맷 가져오기 옵션 프롬프트에서 오른쪽 하단의 확인 버튼을 클릭하세요. 그 다음 바이오 형식 시리즈 옵션 프롬프트에서 시리즈 1이 선택되었는지 확인하세요. 왼쪽 하단에서 확인 버튼을 클릭하세요.

이미지가 로드되면, 이미지를 선택하여 신호를 분리하세요. 색상을 선택하고 분할 채널을 선택하세요. GFP 표지 핵과 RFP 표지 염색질에 대해 별도로 생성된 창을 확인하세요.

두 이미지 창 중 어느 것이 크로마틴에 해당하는지 결정하세요. 크로마틴 이미지 창을 클릭한 후, Image를 선택하고 Stacks를 선택한 후 메인 ImageJ 창에서 Z 프로젝트를 클릭하여 Z 프로젝트 작업을 적용합니다. 투사 유형을 최대 강도로 변경하세요.

모든 시간 프레임이 활성화되어 있는지 확인하고, 확인 버튼을 눌러 투영을 생성하세요. Contrast 메뉴를 열려면 Control Shift C를 누르거나, Image를 선택한 후 Adjust를 선택한 후 메인 ImageJ 창에서 Brightness 또는 Contrast를 클릭하세요. 최소 막대를 왼쪽으로 밀어 크로마틴이 명확히 보일 때까지 유지하세요.

플러그인으로 이동하세요. 플러그인 메뉴에서 아래쪽 화살표를 클릭하면 트래킹 옵션으로 스크롤됩니다. 추적을 선택하고 TrackMate를 클릭하세요.

보정 설정이 정확한지 확인하고 다음(Next)을 클릭하세요. 임계값 감지기를 선택하고 다음을 클릭하세요. 이미지 창에서 타임랩스의 마지막 프레임으로 이동하세요.

강도 임계값 옆에 있는 '자동'을 클릭하고 '미리보기'를 클릭하세요. 강도 임계값을 조정하고 미리보기를 클릭하세요. 조정과 미리보기 과정을 반복하여 모든 염색질이 최소한의 노이즈로 포함될 때까지 반복한 후 다음을 클릭하세요.

초기 임계값 감지가 완료될 때까지 기다리고, 다음을 클릭하세요. 임계값을 수동으로 조정해 크로마틴만 보이게 한 후 다음을 클릭하세요. 형광 이미지 디스플레이를 조정하고 다음을 클릭하세요.

Simple LAP Tracker를 선택하고 다음을 클릭하세요. 연결 최대 거리를 5마이크론, 거리 닫는 최대 거리를 15마이크론, 최대 프레임 간격 닫힘 거리를 1로 설정한 후 다음을 클릭하세요. 추적이 완료되도록 기다려 주세요.

원본 이미지 창에 표시된 트랙을 보고 다음을 클릭하세요. 왼쪽 하단의 초록색 플러스 버튼을 눌러 필터를 생성하세요. 트랙 모드에서 자리 수를 선택하세요.

임계값 슬라이더를 조정하세요. 필터 모드가 위로 설정되어 있는지 확인한 후 다음을 클릭하세요. 디스플레이 옵션 페이지 하단의 트랙 버튼을 클릭하세요.

CSV로 내보내기를 선택하세요. 내장된 플롯 페이지를 무시하고 다음(Next)을 클릭하세요. TrackMate 분석 결과를 검토하세요.

캡처 오버레이를 클릭한 후 실행을 선택하세요. 파일을 선택하고 '다른 이름으로 저장'을 클릭한 후 GIF를 선택해 영상을 저장하세요. 염분 처리된 뿌리 세포는 스트레스를 받는 것으로 나타났고, 중심체 초점은 대조군 조건보다 더 컸다.

대조군 조건에서 크로마틴 속도는 100밀리몰라 염화나트륨 처리 조건보다 유의미하게 높았다. 이 프로토콜은 애기장대 뿌리에서 형광 표지된 단백질의 이동을 시간에 따라 추적하고 정량화할 수 있게 합니다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 도전은 고품질 이미지를 얻는 것으로, 사진 표백과 샘플 드리프트로 인해 추적이 어려워질 수 있습니다.

향후 연구에서는 우리 연구에서 관찰된 크로마틴 이동 감소의 기전을 조사해야 합니다.