CaMPARI를 이용한 초파리 유충 중추신경계에서 개별 시냅스 전후 파트너의 기능적 특성 분석
June 16th, 2026
이 프로토콜은 유전적으로 인코딩된 도구를 사용하여 Drosophila melanogaster 유충의 중추신경계에서 정의된 신경 파트너 간의 기능적 시냅스 활동을 생체 내에서 평가합니다. CsChrimson 매개 광유전학적 자극은 시냅스 전 감각 신경세포 cIVda 신경세포를 유발하여 시냅스 후 분지 4 중간뉴런에서 CaMPARI의 칼슘 의존적 광변환을 유도합니다.
우리의 연구는 생존 및 해부된 Drosophila 유충에서 정의된 신경 노드 파트너 간의 기능적 시냅스 연결성을 평가하는 데 중점을 두고 있습니다. 기존 방법은 해부 또는 물리적 자극을 필요로 합니다. 이 프로토콜은 완전한 유충에서 광유전학을 사용하여 인공물을 줄입니다.
시작하려면, 옥수수 가루 아가르 매체를 전자레인지에서 8-10초 동안 끓이지 않고 녹이고 굳지 않도록 실온에서 식힙니다. 완전한 냉각 전에, all-trans-레티날 또는 ATR을 0.5 밀리몰라 농도로 첨가하여 송아지에 필요한 csChrimson 활성화를 보충합니다. 빛 노출을 방지하기 위해 바이알을 알루미늄 호일로 완전히 덮으십시오.
CaMPARI 및 csChrimson 유전자를 소유한 처녀 암컷을 GAL4 및 LexA 드라이버 유전자를 소유한 수컷과 섞어 준비된 매체를 담은 플라스틱 바이알에서 교차합니다. ATR 없이 준비된 바이알을 대조군으로 준비합니다. 유충이 3령 단계에 도달할 때까지 바이알을 25도 섭씨에서 배양합니다.
붓을 사용하여 3령 유충을 수집합니다. 0.1 몰러 PBS가 담긴 3웰 마이크로 스팟 플레이트에서 유충을 헹구어 붙어있는 음식을 제거합니다. 깨끗한 18 x 18 밀리미터 커버 슬라이드의 각 모서리에 작은 양의 모델링 점토를 놓습니다.
유충을 커버 슬라이드에 PBS 방울 위에 배치하고 배쪽이 아래로 방향을 향하도록 합니다. 유충을 포함하는 커버 슬라이드 위에 깨끗한 현미경 슬라이드를 놓습니다. 충분한 압력을 가하여 유충을 압박하거나 유리를 부수지 않고 유충을 고정시키기 위해 모서리에 모델링 점토를 적용하여 커버 슬라이드를 고정합니다.
유충을 포함하는 슬라이드를 40x/1.2 굴절률 렌즈가 장착된 공초점 현미경의 무대에 놓습니다. 현미경 소프트웨어 인터페이스에서 Live를 클릭합니다. 그런 다음 Z Stack 패널 아래에서 Set First를 클릭한 다음 Set Last를 클릭하고 Stop을 클릭하여 CaMPARI를 발현하는 시냅스 후 뉴런의 기본 Z Stack을 획득합니다.
Channels 메뉴에서 488 나노미터 녹색 채널을 0.8% 레이저 파워로 설정합니다. 다음으로, 561 나노미터 빨간색 채널을 0.8% 레이저 파워로 설정합니다. Z Stack 메뉴에서 Interval 값을 1 마이크로미터로 설정합니다.
Acquisition 메뉴에서 Presets를 선택하여 256 x 256 픽셀 해상도를 설정합니다. 2의 라인 평균화 값, 양방향 스캔 및 9의 스캔 속도를 선택하여 자동 픽셀 시간 업데이트를 허용합니다. 실험 전체에서 동일한 획득 파라미터를 유지하면서 어두운 환경에서 모든 이미지를 촬영합니다.
405 나노미터 광변환 광을 0.5% 레이저 파워로 설정합니다. 그리고 561 나노미터 광유전학적 자극 광을 0.8% 레이저 파워로 설정합니다. Live를 클릭한 다음 히스토그램 패널에서 Best Fit을 선택합니다.
두 레이저가 동시에 30초 동안 유충을 자극하고 그 후 자극을 중단합니다. 기준선과 동일한 매개변수를 사용하여 자극 후 ZStack 획득 중에, ATR로 먹인 유충의 레이저 자극 뉴런에서 최소한의 광변환과 대조군에서 빨간 CaMPARI 형광을 관찰합니다. Fiji ImageJ 소프트웨어에서 파일을 클릭한 다음 열기를 선택합니다.
기본 설정과 함께 BioFormats 가져오기 옵션 창에서 확인을 클릭하여 획득된 ZStack 이미지를 엽니다. 이미지 메뉴에서 색상을 선택한 다음 채널 분할을 선택하여 획득된 이미지의 빨간색 및 녹색 채널을 봅니다. 배경 빼기를
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Overview
This article presents a method to functionally validate synaptic connectivity in the Drosophila larval nervous system by combining optogenetic activation with CaMPARI-based calcium imaging. The approach enables researchers to assess activity-dependent synaptic signaling between identified sensory neurons and interneurons in intact, undissected third-instar larvae.
Key Study Components
Area of Science
- Neurobiology
- Functional connectomics
- Optogenetics
- Calcium imaging
Background
- Connectome studies have mapped synaptic connectivity in various species, including Drosophila.
- Electron microscopy provides detailed anatomical data but lacks functional information.
- Recent Drosophila research has identified key neuronal networks underlying specific behaviors, such as nociception.
- Class IV dendritic arborization (cIVda) sensory neurons form major synaptic contacts with Basin-4 interneurons by the third instar larval stage.
Purpose of Study
- To functionally assess synaptic connectivity between cIVda nociceptors and Basin-4 interneurons in Drosophila larvae.
- To demonstrate the utility of CaMPARI as an activity-dependent reporter in live, undissected larvae.
- To establish a proof-of-principle protocol combining optogenetic stimulation and CaMPARI photoconversion.
Methods Used
- Immobilization of third-instar Drosophila larvae on microscope slides.
- Optogenetic activation of cIVda nociceptors using the red-shifted channelrhodopsin CsChrimson.
- Simultaneous CaMPARI photoconversion in Basin-4 interneurons to detect calcium influx.
- Fluorescence imaging to monitor CaMPARI color change as a readout of synaptic activity.
Main Results
- Calcium-dependent photoconversion of CaMPARI was observed in Basin-4 interneurons following optogenetic stimulation of cIVda neurons.
- The method provided functional evidence of synaptic connectivity despite internal larval movements and focal plane changes.
- The approach validated the anatomical connections identified by connectome studies with functional data.
Conclusions
- CaMPARI-based photoconversion is a reliable indicator of synaptic activation in intact Drosophila larvae.
- The protocol enables functional validation of connectomic data in vivo.
- This method can be broadly applied to study neuronal network function in genetically tractable organisms.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Functional validation of synaptic connectivity is critical for de-risking target selection and advancing mechanistic understanding in neurobiology-driven drug discovery. This CaMPARI-based approach enables direct assessment of activity-dependent signaling between defined neuronal partners in intact systems, bridging the gap between anatomical connectomics and actionable functional data. Such methods enhance predictive confidence at the target validation and early discovery inflection points, supporting portfolio decisions in CNS and neurodevelopmental pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of functional synaptic connectivity beyond anatomical mapping.
- Supports mechanistic de-risking by confirming physiologically relevant neuronal interactions.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Facilitates development of validated, activity-dependent readouts for neuronal assays.
- Provides quantitative, ratiometric outputs suitable for reproducible screening workflows.
- Enables robust assay standardization by integrating optogenetic stimulation with functional imaging.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional synaptic data with disease-relevant neural circuits in preclinical models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking connectomic and functional endpoints.
- De-risks translational biomarker strategies by confirming in vivo neuronal activity patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through assay development and preclinical research, providing a reusable platform for functional connectomics in genetically tractable systems.
- Discovery Biology: Validates synaptic function and pathway engagement in intact neural circuits.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables ratiometric measurement of calcium-dependent activity for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges anatomical and functional data to inform disease-relevant model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable workflow adaptable to diverse neuronal targets and circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes functional readouts and supports reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes targets with validated functional relevance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of CNS and neurodevelopmental programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, calcium imaging, and genetic model systems.
- Needs fluorescence microscopy infrastructure and precise light delivery systems.
- Demands cross-team standardization for assay reproducibility and data interpretation.
- Adaptation to other model systems depends on genetic tractability and optical accessibility.
- Internal movement and focal plane changes in live imaging must be managed for reliable outputs.