CaMPARI를 이용한 초파리 유충 중추신경계에서 개별 시냅스 전후 파트너의 기능적 특성 분석

우리 연구는 살아있는 및 해부된 초파리 유충에서 정의된 신경 노드 파트너 간의 기능적 시냅스 연결성을 평가하는 데 중점을 두고 있습니다. 기존의 방법은 해부나 물리적 자극이 필요합니다. 이 프로토콜은 온전한 유충에서 광유전학을 사용하여 인공물을 줄입니다.

먼저, 옥수수 가루 한천 배지를 전자레인지에서 끓이지 않고 8-10초간 녹인 뒤, 고체화되지 않고 실온에서 식히세요. 완전 냉각 전에, csChrimson 활성화가 필요한 파리를 위해 배지를 보완하기 위해 0.5밀리몰라 농도의 올트랜스레티날(ATR)을 첨가합니다. 빛 노출을 막기 위해 바이알을 알루미늄 호일로 완전히 덮으세요.

CaMPARI와 csChrimson 유전자를 가진 처녀 여성과 GAL4 및 LexA 드라이버 유전자를 가진 남성을 플라스틱 바이알에 담아 혼합 배지를 사용한다. ATR이 없는 병렬 바이알을 준비하세요. 유충이 3기 단계에 도달할 때까지 25도 섭씨에서 배양합니다.

붓으로 3령 유충을 채집하세요. 유충을 0.1 몰라 PBS가 포함된 3웰 마이크로 스팟 플레이트에 세척하여 달라붙은 영양분을 제거합니다. 깨끗한 18 x 18mm 커버 슬립의 각 모서리에 조금씩 조금의 모델링 점토를 놓으세요.

유충을 덮개 슬립에 PBS 한 방울에 넣고 배쪽이 아래로 향하도록 두세요. 유충이 들어있는 덮개 위에 깨끗한 현미경 슬라이드를 올려놓으세요. 커버 슬립을 모서리에 모델링 점토를 바르고, 유충을 으스러뜨리거나 유리를 깨지 않도록 적당한 압력으로 고정하세요.

유충이 담긴 슬라이드를 40x/1.2 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경 스테이지에 올려놓습니다. 현미경 소프트웨어 인터페이스에서 'Live'를 클릭하세요. 그 다음 Z 스택 패널 아래에서 Set First, 그리고 Set Last, Stop을 클릭하면 CaMPARI를 표현하는 시냅스 후 뉴런의 기준 Z 스택을 얻을 수 있습니다.

채널 메뉴에서 488나노미터 녹색 채널을 0.8% 레이저 출력으로 설정하세요. 다음으로, 561 나노미터 빨간 채널을 0.8% 레이저 출력으로 설정하세요. Z 스택 메뉴에서 간격 값을 1마이크로미터로 설정하세요.

획득 메뉴에서 Preset을 선택하여 256 x 256 픽셀 해상도를 설정하세요. 라인 평균 값 2, 양방향 스캐닝, 스캔 속도 9를 제공해 픽셀 시간을 자동으로 업데이트할 수 있습니다. 모든 영상 촬영은 어두운 환경에서 수행하며, 실험 내내 동일한 획득 매개변수를 유지합니다.

405나노미터 광변환광을 0.5% 레이저 출력으로 설정하세요. 그리고 561나노미터 광유전학적 자극 광을 0.8% 레이저 출력으로 변환합니다. Live를 클릭한 후 히스토그램 패널에서 Best Fit을 선택하세요.

두 레이저가 유충을 동시에 30초간 자극한 후 중단하세요. 기초와 동일한 매개변수를 사용하여 자극 후 ZStack 획득 중, 최소한의 광변환과 대조군으로 ATR 영양 유충의 레이저 자극 뉴런에서 붉은 CaMPARI 형광을 관찰합니다. Fiji ImageJ 소프트웨어에서 파일을 클릭한 후 열기를 선택하세요.

BioFormats 가져오기 옵션 창에서 기본 설정으로 확인 버튼을 눌러 획득한 ZStack 이미지를 엽니다. 이미지 메뉴에서 색상을 선택한 후 채널 분할을 선택하여 획득한 이미지의 빨강과 초록 채널을 확인하세요. 배경 감산을 원하시면 '프로세스'를 클릭한 후 '배경 빼기'를 선택하세요.

팝업 창에서 롤링 볼 반경을 50픽셀로 설정한 후 확인을 클릭한 후 프로세스 스택 창에서 예(Yes)를 선택하세요. 다음으로 분석 메뉴에서 도구를 선택한 후 ROI 관리자를 선택해 ROI 창을 열어보세요. 자유손으로 선택 도구를 사용해 각 셀 주변의 관심 영역을 윤곽선으로 표시하세요.

ROI 창에서 선택한 개요를 저장하려면 추가를 선택하세요. 그 다음 측정을 클릭하여 면적, 평균, 표준편차, 통합 밀도 결과를 생성합니다. 같은 유충의 여러 세포에 대해 녹색과 빨간색 채널을 각각 반복하는 과정입니다.

결과를 스프레드시트로 내보내 후, 각 세포별 적집 밀도의 빨강-초록 또는 R 대 G 비율을 측정하고, 이 값을 평균하여 자극 전후 이미지 모두에서 유충당 평균 R 대 G 비율을 계산합니다. 마지막으로, 자극 전 R x G 비율을 자극 후 R x G 비율에서 빼서 형광 또는 델타 R by G 변화를 계산하여 시냅스 후 칼슘 활성을 정량화합니다. 3기 유충의 클래스 IV 수지상 형성(cIVda 뉴런)과 분지-4 중간뉴런 간의 기능적 연결성 연구에서는 분지-4 중간뉴런이 광변환 및 광 자극 이전에 세포질 CaMPARI 발현으로 인해 녹색 형광을 보였음을 보여주었다.

기저선 조건에서는 적색 형광이 검출되지 않아 자극 전 광변환이 없음을 확인했습니다. 광변환, 빛 노출, 광유학적 자극을 동시에 수행하여 CaMPARI가 녹색 형광에서 적색 형광으로 변환되었습니다. 대조군에서 적색 형광이 없다는 것은 광변환이 csChrimson 매개 신경 활동에 의해 특별히 촉진되었음을 나타냅니다.

녹색 형광에 의한 델타 레드는 실험 동물에서 ATR 없는 대조군보다 유의하게 높았습니다. 이 프로토콜은 생체 발달 동물에서 시냅스 전 자극과 즉각적인 시냅스 후 반응을 추적하여 시냅스 동반자 관계를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 가장 어려운 단계는 적절한 동물 고정 시행이 동물을 해치지 않으면서도 움직임을 막을 수 있는 충분한 압력이 필요하다는 점입니다.

향후 연구는 발달 동물 중 특정 신경 집단 간의 시냅스 연결을 추적, 형성, 강화, 심지어 제거하는 데 기여할 수 있을 것입니다.