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본 연구는 대만 교육부(MOE)의 고등교육 새싹 프로젝트(Higher Education Sprout Project) 프레임워크 내 중점 분야 연구 센터 프로그램의 지원을 받아 중국 의과대학교 암 생물학 및 정밀 치료 센터(Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University)의 후원으로 수행되었습니다(CBPTC-PROJ-5-2).
연구비 지원과 학술적 지원을 제공해주신 암생물학 및 정밀치료 센터(Cancer Biology and Precision Therapeutics Center)에 감사드립니다.

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저자들은 이해 상충이 없음을 밝힙니다.

이 프로토콜의 여러 단계는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. 첫째, PBMC 분리의 품질과 순도는 대식세포의 수율과 분화 효율에 직접적인 영향을 미칩니다. 희석된 혈액을 Ficoll 밀도 구배 위에 조심스럽게 층적하고 브레이크를 끈 상태로 원심분리하는 것이 버피코트(buffy coat) 인터페이스를 보존하는 데 필수적입니다. RBC 용해가 불완전하거나 용해 버퍼에서의 배양 시간이 과도하면 PBMC의 생존율이 저하됩니다. 둘째, 식세포 작용 분석 전에 유세포 분석을 통해 전염증성 대식세포 분극화를 확인해야 합니다. CD80을 상향 조절하지 못한 대식세포는 식세포 능력이 감소하여 anti-CD24 항체 매개 효과의 해석에 혼란을 줄 수 있습니다. 셋째, 암세포의 탈착 방법이 중요합니다. 효소적 소화로 인해 세포 표면에서 CD24가 절단되어 항체 결합 효율이 감소할 수 있으므로 트립신 처리는 피해야 합니다. EDTA 기반의 탈착 방식은 표면 항체의 무결성을 보존하므로 이를 권장합니다.
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유방암은 전 세계 여성에게서 가장 빈번하게 진단되는 악성 종양으로, 매년 약 230만 명의 신규 사례가 보고됩니다1. 이 질환은 임상적으로 이질적이며, 호르몬 수용체인 에스트로겐 수용체(ER) 및 프로게스테론 수용체(PR)의 상태와 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2) 온코진의 발현 여부에 따라 최소 4가지의 주요 분자 아형으로 분류됩니다2. 루미날 A(Luminal A) 종양은 HER2 과발현 없이 ER 및/또는 PR을 발현하며(ER/PR+ 및 HER2−), 루미날 B(Luminal B) 종양은 ER/PR과 HER2를 함께 발현합니다(ER/PR+ 및 HER2+). HER2+ 종양은 호르몬 수용체 상태와 관계없이 높은 HER2 발현을 특징으로 하며, 삼중음성 유방암(TNBC)은 세 가지 마커 모두의 발현이 결여되어 있습니다(ER−, PR−, HER2−)2,3. 이러한 아형 중 TNBC는 임상적으로 가장 까다로운 형태이며 전체 유방암의 약 15%~20%를 차지합니다. TNBC 환자는 기존 화학요법에 대한 반응이 낮고 효과적인 표적 치료제가 없기 때문에, 가장 공격적인 질병 경과를 보이며 예후가 가장 나쁘고 5년 전체 생존율이 가장 짧습니다3,4. 또한, TNBC는 내장 전이, 특히 진단 후 5년 이내에 폐로 전이될 가능성이 매우 높으며, 진행성 또는 전이성 TNBC(mTNBC) 환자의 중앙 생존 기간은 2년을 넘는 경우가 드뭅니다5,6. 이러한 통계는 TNBC를 위한 새로운 치료 전략에 대한 절실하고 미충족된 필요성을 강조합니다.
종양 미세환경(TME)은 유방암의 진행과 면역 회피에 중추적인 역할을 합니다. 종양 관련 대식세포(TAM)는 TME 내에서 가장 풍부한 면역 세포 중 하나이며, 최근 선천적 항종양 면역의 핵심 매개체로 인식되었습니다7,8,9. 과거에는 TAM을 염증 촉진성 “M1”과 종양 촉진성 “M2” 상태로 구분하였으나, 이러한 이분법적 모델은 대식세포의 실제 이질성을 충분히 설명하지 못합니다. 대신, TAM은 TME 내의 다양한 생화학적 신호에 반응하여 진화하며 역동적인 기능적 스펙트럼을 형성합니다. 이러한 복잡한 환경 속에서 암세포는 다양한 면역 회피 전략, 특히 “don’t eat me” 신호의 과발현을 통해 대식세포의 활성을 적극적으로 무력화합니다. CD47/SIRPα 축은 이러한 맥락에서 처음으로 확인된 선천 면역 체크포인트였으며6,10, 최근에는 CD24가 새롭고 강력한 항식세포 작용 신호로 등장했습니다11,12. CD24는 glycosylphosphatidylinositol 결합을 통해 세포막에 고정된 작고 고도로 당화된 뮤신형 당단백질입니다13. 이는 생리적 조건 하에서 다양한 면역 세포 계통에 발현되지만, 유방암, 난소암, 췌장암 및 대장암을 포함한 고형암에서 빈번하게 과발현됩니다14. 종양 세포에서 CD24는 대식세포에 발현된 억제 수용체인 sialic acid–binding immunoglobulin-like lectin 10(Siglec-10)과 결합합니다. 이 상호작용은 Siglec-10의 세포질 꼬리에 있는 immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif 도메인의 인산화를 유도하여, 하위 식세포 신호 전달을 억제하는 SHP-1 및 SHP-2 포스파타아제를 활성화합니다11. 단클론 항체로 CD24/Siglec-10 상호작용을 차단하면 대식세포에 의한 CD24 발현 인간 종양의 식세포 작용이 강력하게 증강되는 것으로 나타났습니다. 또한 최근 연구에서 유방암 세포의 CD24a를 녹아웃(knockout)시키면 마우스 삼중음성 유방암 모델에서 대식세포 식세포 작용에 대한 감수성이 증가함을 보여주었습니다9.
항체 의존성 세포 포식 작용(ADCP)은 항체가 대식세포로 하여금 종양 세포를 포식하도록 유도하는 핵심 기전입니다15,16. 항체가 종양 발현 항원에 결합하면, 항체의 Fc 영역이 대식세포의 Fcγ 수용체(FcγRs)와 결합하여 세포 내 신호 전달 폭포를 유발하며, 이는 최종적으로 세포골격 재배열, 포식 컵 형성 및 표적 세포의 섭취로 이어집니다17.
본 연구에서는 유방암 세포에 대한 항체 유도 대식세포 식작용을 측정하기 위한 타임랩스 살아있는 세포 이미징 프로토콜을 개발하고 검증하였습니다. 이 방법은 건강한 인간 공여자로부터 얻은 말초혈액 단핵구(PBMC) 유래 대식세포를 사용하며, 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)로 분화시킨 후 리포폴리사카라이드(LPS)와 인터페론 감마(IFN-γ)로 자극하여 준비합니다. 유세포 분석 결과, 자극 후 CD11b⁺ 집단 내에서 CD80의 상향 조절이 확인되었으며(그림 1), 이는 전형적 활성화 표현형을 뒷받침합니다. 이러한 활성화 상태는 강력한 항체 매개 식작용 능력을 부여하여, 항체 의존성 세포 식작용(ADCP)을 평가하는 데 적합합니다. GFP가 태그된 CD24 양성 유방암 세포를 표적 세포로 사용하며, 공동 배양 전 치료용 anti-CD24 단클론 항체로 옵소닌화합니다. 식작용 과정은 제어된 환경 조건 하에서 자동 현미경을 사용하여 16시간 동안 기록됩니다. 동적인 시각화와 병행하여 정량적 평가를 가능하게 하기 위해, 동일한 공동 배양 조건에서 별도의 엔드포인트 분석을 수행하여 내부로 섭취되지 않은 표적 세포를 제거한 후 식작용을 엄격하게 측정합니다. 이 프로토콜은 anti-CD24 항체에 의해 매개되는 ADCP를 평가하기 위한 표준화되고 재현 가능하며 시각적 정보가 풍부한 플랫폼을 제공합니다. 특히, 타임랩스 이미징과 보완적인 엔드포인트 기반 정량화 전략의 통합을 통해 식작용의 역학(kinetics)과 규모를 동시에 평가할 수 있습니다. 이 방법은 다른 대식세포 표적 면역치료 타겟을 조사하는 데에도 응용될 수 있습니다. 본 프로토콜은 암세포 표면 항체에 대한 치료용 단클론 항체에 의해 매개되는 ADCP를 평가하는 데 가장 적합합니다. 또한 후보 항체의 비교 스크리닝, 용량-반응 특성 분석, 그리고 "don't-eat-me" 신호 차단(예: CD47–SIRPα)의 효과를 포함한 Fc–FcγR 결합의 기전 연구에 매우 유용합니다. 이 분석법은 일차 인간 대식세포를 사용하므로, 임상 개발 전 공여자 간 변동성 평가가 필요한 중개 연구에도 적합합니다.
<img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71461/71461fig1.jpg" /> 
그림 1. 말초혈액 단핵구 유래 IFN-γ/LPS 자극 대식세포의 생성 및 유세포 분석 검증.상단 패널: 건강한 공여자의 말초혈액 단핵구(PBMCs)를 Ficoll 용액을 사용하여 20°C에서 400 × g로 30분 동안 밀도 구배 원심분리하여 분리하며, 모든 시약은 20°C ± 2°C로 사전 평형화한다. 분리된 PBMCs를 100 ng/mL 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)가 첨가된 ImmunoCult-SF 배지에서 7일 동안 배양하여 대식세포 분화를 유도하고(Day 0–7), 5일째에 배지를 보충한다. 8일째에 분화된 대식세포를 100 ng/mL IFN-γ와 1 µg/mL LPS로 48시간 동안 자극한다(Day 8–10). 이후 세포를 유세포 분석으로 분석한다. 하단 패널: 대식세포의 유세포 분석. 세포를 CD11b-FITC, CD80-PE 및 CD206-PerCP-Cy5.5로 구성된 표면 패널로 염색한 후, 데이터 획득 전 사멸 세포를 제외하기 위해 DAPI를 첨가한다. 게이팅 전략: 먼저 생존 세포(DAPI⁻)를 게이팅한 후, CD11b-FITC 대 FSC-A 플롯에서 CD11b⁺를 식별하여 대식세포임을 확인한다. 이후 생존 CD11b⁺ 이벤트를 CD80 대 CD206 도트 플롯으로 분석하여 IFN-γ/LPS 자극에 의해 유도된 CD80⁺CD206⁻ 집단을 확인한다. 오른쪽: CD11b-FITC 대 FSC-A의 대표 도트 플롯으로, 게이팅된 세포의 99.8%가 CD11b⁺임을 보여주어 대식세포임을 확인한다. 왼쪽: CD11b⁺ 세포의 대부분이 CD80⁺CD206⁻ 게이트(Q1: 95.2%) 내에 분포하며, 이는 적용된 자극 조건 하에서 예상되는 전염증성 표현형을 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71461/71461fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 기술을 적용할 때 사용자는 몇 가지 제약 사항을 고려해야 합니다. 첫째, PBMC 유래 대식세포의 공여자 간 변동성은 식세포 작용 결과에 상당한 편차를 유발할 수 있으므로, 여러 명의 공여자(n ≥ 3)를 사용하고 통합 결과와 함께 개별 공여자 데이터를 보고할 것을 권장합니다. 둘째, 2D 공배양 형식은 종양 미세환경을 완전히 재현하지 못하므로, 임상적 추론을 내리기 전에 3D 또는 in vivo 모델에서 결과를 검증해야 합니다. 셋째, 16시간의 이미징 창은 초기 식세포 작용 사건을 포착하지만, 항원 제시나 2차 면역 활성화와 같은 장기적인 과정은 반영하지 않습니다. 따라서 실시간 이미징과 최종 시점 정량화를 병행하여 사용하는 것은 ADCP 측정의 해석 가능성과 재현성을 모두 높이는 상호 보완적인 체계를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 스톡 용액</td><td>Sigma-Aldrich(또는 동등 제품)</td><td>E7889 (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>세포 분리를 위한 PBS 내 10 mM EDTA 작업 용액 제조에 사용됨</td></tr><tr><td>24-웰 조직 배양 플레이트 (TC 처리됨)</td><td>Corning (또는 동등 제품)</td><td>3524</td><td>식세포 작용 분석 시 대식세포와 암세포의 공배양에 사용됨</td></tr><tr><td>항인간 CD206 항체 (유세포 분석법)</td><td>BioLegend (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>321122 (또는 해당 동등 제품)</td><td>대안적 대식세포 표현형 마커</td></tr><tr><td>항인간 CD24 단클론 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>MA1-91384 (또는 그에 상응하는 제품)</td><td>항체 의존적 식세포 작용을 위해 암세포를 옵소닌화하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>환경 제어 챔버가 장착된 자동화 라이브 셀 이미징 시스템(예: Lionheart FX)</td><td>Agilent Technologies (또는 그와 동등한 제품)</td><td>BioTek Lionheart FX 자동 현미경</td><td>제어된 온도 및 환경 하에서 장기간의 타임랩스 이미징을 가능하게 합니다. &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 조건</td></tr><tr><td>자동 라이브 셀 이미징을 위한 이미징 소프트웨어 (예: Gen5)</td><td>Agilent Technologies (또는 동등 제품)</td><td>제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 입력해 주세요.</td><td>타임랩스 이미징 데이터의 획득 및 분석에 사용됨</td></tr><tr><td>원심분리기 (스윙 버킷 로터)</td><td>Thermo Fisher Scientific (또는 동등 제품)</td><td>TX-1000 로터가 장착된 Multifuge X4R Pro (또는 동등 제품)</td><td>PBMC 분리 및 세포 세척 단계에 사용됨</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 인큐베이터 (37°C)&amp;deg;C, 5% &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Thermo Fisher Scientific (또는 동등 제품)</td><td>Forma 직접 가열 방식 &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 배양기 (또는 그에 상응하는 장비)</td><td>세포 배양을 위한 생리학적 조건 유지</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 레귤레이터가 장착된 가스 공급 장치</td><td>Agilent Technologies (또는 동등 제품)</td><td>해당 없음</td><td>준비물 &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 인큐베이터 및 이미징 시스템의 환경 제어를 위해</td></tr><tr><td>원심분리관 (15 mL 및 50 mL)</td><td>Corning (또는 그에 상응하는 제품)</td><td>352070 (또는 동등 제품)</td><td>PBMC 분리, 세척 및 원심분리 단계에 사용됨</td></tr><tr><td>EDTA 코팅 혈액 수집관(vacutainers)</td><td>BD Biosciences (또는 그에 상응하는 제품)</td><td>367863 (또는 이에 상응하는 것)</td><td>기증자로부터 전혈 샘플을 채취하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Cytiva (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>17144003 (또는 그에 상응하는 제품)</td><td>PBMC 분리를 위한 밀도 구배 매질</td></tr><tr><td>유세포 분석기 (예: FACSCanto II)</td><td>BD Biosciences (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>BD FACSCanto II&amp;nbsp;</td><td>대식세포의 표현형 분석에 사용됨</td></tr><tr><td>보정 비드 (유세포 분석법)</td><td>Biolegend (또는 동등 제품)</td><td>424602</td><td>단색 보정 컨트롤용으로 사용됨</td></tr><tr><td>FITC 표지 인간 CD11b 항체 (유세포 분석용)</td><td>BioLegend (또는 그에 상응하는 제품)</td><td>101205 (또는 그에 상응하는 제품)</td><td>대식세포 식별에 사용되는 마커</td></tr><tr><td>PE 표지 항인간 CD80 항체 (유세포 분석법)</td><td>BioLegend (또는 동등 제품)</td><td>375410 (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>활성화된 대식세포 표현형과 관련된 마커</td></tr><tr><td>GFP 발현 유방암 세포주 (MDA-MB-468)</td><td>ATCC (또는 그에 상응하는 기관)</td><td>HTB-132 (또는 동등 제품)</td><td>식세포 작용 분석에 사용되는 표적 세포; GFP를 통해 시각화 가능</td></tr><tr><td>ImmunoCult-SF 대식세포 배지</td><td>STEMCELL Technologies (또는 그와 동등한 제품)</td><td>10961 (또는 이에 상응하는 것)</td><td>대식세포 분화에 사용되는 무혈청 배지</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;듀롱킨 변형 이글 배지(DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>12100046</td><td>암세포의 배양 및 재부유에 사용됨</td></tr><tr><td>동형 대조군 항체 (IgG)</td><td>Bio X Cell (또는 그와 동등한 제품)</td><td>BE0297 (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>항체 의존성 식세포 작용 분석을 위한 음성 대조군</td></tr><tr><td>리포폴리사카라이드 (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich (또는 그에 준하는 제품)</td><td>L2630 (또는 그에 상응하는 제품)</td><td>IFN-γ와 병용하여 대식세포를 활성화하는 데 사용되는 자극제&amp;gamma;</td></tr><tr><td>재조합 인간 인터페론 감마 (IFN-&amp;gamma;)</td><td>STEMCELL Technologies (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>78020 (또는 동등 제품)</td><td>대식세포 활성화에 사용되는 사이토카인</td></tr><tr><td>재조합 인간 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF)</td><td>STEMCELL Technologies (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>78057 (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>대식세포 분화에 사용되는 성장 인자</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 또는 세롤로지컬 피펫</td><td>Jetbiofil (또는 그와 동등한 제품)</td><td>GSP010010 (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>PBMC 분리 및 세포 배양 중 액체 핸들링에 사용됨</td></tr><tr><td>PBS (Ca²⁺-free)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-free)</td><td>Thermo Fisher Scientific (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>BP399-500 (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>세포 세척 및 희석 단계에 사용되는 완충액</td></tr><tr><td>페트리 접시 (100 mm, 비처리)&amp;ndash;(조직 배양 처리된)</td><td>Corning (또는 동등 제품)</td><td>430591</td><td>부착 선택을 통한 대식세포 분화에 사용됨</td></tr><tr><td>적혈구(RBC) 용해 버퍼</td><td>BioLegend (또는 그에 상응하는 제품)</td><td>420301 (또는 그에 상응하는 제품)</td><td>PBMC 분리 과정 중 적혈구를 제거하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>Viobility 405/452 Fixable Dye</td><td>Miltenyi Biotec (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>130-130-404 (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>유세포 분석 중 세포 생존율을 평가하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich (또는 동등 제품)</td><td>D9542 (또는 이에 상응하는 제품)</td><td>유세포 분석에서 사멸 세포 배제를 위해 사용됨</td></tr></tbody></table>

녹색 형광 단백질로 표지된 삼중음성 유방암 세포의 항체 유도 대식세포 식작용에 대한 타임랩스 이미징

Time-Lapse Imaging of Antibody-Driven Macrophage Phagocytosis of Green Fluorescence Protein&#8211;Labeled Triple-Negative Breast Cancer Cells

항체 의존성 세포 식세포 작용(Antibody-dependent cellular phagocytosis)은 대식세포가 항체로 옵소닌화된 암세포를 engulf 하는 주요 기전입니다. 본 프로토콜은 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein)로 표지되고 CD24를 발현하는 삼중 음성 유방암 세포에 대한 항체 의존성 대식세포 식세포 작용을 시각화하기 위한 타임랩스 살아있는 세포 이미징 방법을 설명합니다. 대식세포는 인간 말초혈액 단핵구에서 유래하여 대식세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony–stimulating factor)로 분화시키고, 인터페론 감마(interferon gamma)와 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 사용하여 염증성 표현형으로 분극화하여 생성합니다. 암세포는 정의된 작동세포 대 표적세포 비율(effector-to-target ratio)로 대식세포와 공동 배양하기 전에 anti-CD24 단클론 항체로 옵소닌화합니다. 식세포 작용 과정은 생리적 조건을 유지하기 위한 환경 제어 장치가 장착된 자동 현미경을 사용하여 16 h 동안 기록합니다. 이미징은 명시야 및 형광 채널을 사용하여 수행되며, 이를 통해 암세포를 식별하고 대식세포에 의한 내부화를 모니터링할 수 있습니다. 대표적인 타임랩스 이미지는 시간이 경과함에 따라 형광 암세포가 점진적으로 engulf 되는 모습을 보여줍니다. 정량적 평가를 위해 동일한 공동 배양 조건 하에서 병행 엔드포인트 분석(endpoint assay)을 수행하며, 이때 이미징 전에 내부화되지 않은 암세포를 제거하여 식세포 작용 이벤트를 정확하게 측정할 수 있도록 합니다. 이 방법은 in vitro에서 항체 주도 대식세포 식세포 작용을 시각화하기 위한 표준화되고 재현 가능한 접근 방식을 제공합니다. 특히 타임랩스 이미징과 엔드포인트 기반 정량화를 통합함으로써 식세포 작용의 역학과 규모에 대한 상호 보완적인 평가가 가능합니다. 본 프로토콜은 제어된 in vitro 환경에서 치료용 항체 및 대식세포 표적 암 면역 요법의 평가를 지원합니다.

PBMC로부터 대식세포의 성공적인 생성 및 분극화는 형태학적 평가와 유세포 분석을 통해 확인되었습니다(그림 1). 밀도 구배 원심분리로 분리한 PBMC를 M-CSF가 첨가된 배지에서 배양한 결과, 7일 차에 대식세포 특유의 형태를 가진 부착 세포가 생성되었습니다. IFN-γ와 LPS로 자극한 후, 세포들은 적용된 조건 하에서 활성화와 일치하는 표현형을 나타냈습니다. 유세포 분석 결과, 게이팅된 세포의 99.8%가 CD11b 양성으로 나타나 대식세포로 효율적으로 분화되었음을 확인하였습니다(그림 1). CD11b 양성 세포 중 대다수가 CD80⁺CD206⁻ 사분면에 위치(95.2%)하여, 지정된 자극 조건 하에서 성공적으로 분극화되었음을 나타냈습니다. 이러한 결과는 본 프로토콜이 예상되는 마커 발현 프로필을 가진 대식세포를 안정적으로 생성함을 입증합니다.
타임랩스 이미징을 통해...

본 프로토콜은 말초혈액단핵구 유래 대식세포와 자동 현미경을 사용하여, 녹색 형광 단백질로 라벨링된 삼중음성 유방암 세포의 항체 의존적 대식세포 포식 작용을 시각화하는 타임랩스 살아있는 세포 이미징 방법을 설명합니다.

항체 의존성 세포 포식 작용은 대식세포가 항체로 옵소닌화된 암세포를 삼키는 핵심 기전입니다. 본 프로토콜은 ...을 기술합니다.

time-lapse-imaging-antibody-driven-macrophage-phagocytosis-green

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

이 비디오는 독립적인 대식세포 매개 적혈구(RBC) 식세포작용 이벤트를 모니터링하기 위한 분석을 보여줍니다. 마우스 면역글로불린 G(IgG)-옵소니화된 인간 적혈구를 마우스 대식세포와 함께 배양하고 컨포칼 현미경으로 관찰합니다. 적혈구는 식세포컵(phagocytic cup) 형성을 통해 대식세포에 포위되어 리소좀 분해를 목표로 합니다.

IgG-Opsonized 적혈구의 대식세포 식세포작용(Macrophage Phagocytosis)의 실시간 이미징

우리는 안티 - 암 치료에 영상 응답하는 방법을...

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

여기에서는 형광 측정 방법을 사용하여 부착 대식세포 세포주에 의한 형광 입자의 식세포작용을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 입자 내부화의 고처리량 정량화와 그에 따른 액틴 중합화를 용이하게 합니다.

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

이 프로토콜은 단일 셀 해상도 생체 내에서 실시간으로 상호 작용 다세포 장시간 경과 이미징을 수행하는 다 광자 현미경의 사용을 설명한다.

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

여기에서는 암 전이에서 폐포 대식세포의 기능을 연구하기 위한 모델과 접근 방식을 설명합니다. 전이에서 이러한 세포의 역할을 입증하기 위해 클로드로네이트 리포좀을 사용한 폐포 대식세포의 고갈과 함께 유방암의 syngeneic(4T1) 모델을 사용했습니다.

유방암 전이에 폐포 대 식세포의 역할을 공부

우리는 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 대식세포에서 전례 없는 고해상도 phagosome formation 및 close를 3차원으로 시각화하는 실험 설정을 설명합니다. 이를 통해 phagocytic cup의 기저부, 확장된 pseudopods, phagosome scission의 정확한 위치를 모니터링할 수 있습니다.

&quot;Phagosome 폐쇄 분석은&quot;사용하여 입체적으로 Phagosome 형성을 시각화하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)

여기는 마우스 주민 복 막 대 식 세포에 의해 회전 디스크 confocal 현미경 이미지 단일 phagocytic 이벤트를 사용 하 여 방법에 설명 합니다. 프로토콜은 다른 phagocytic 세포를 확장할 수 있습니다.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

암세포, 특히 4T1 마우스 유방 암종 세포에 대한 대식세포 식세포 활성은 본 연구에서 영상화되었다. 살아있는 세포 동배 모델은 형광및 차동 간섭 대조 현미경의 조합을 사용하여 확립되고 관찰되었다. 이 평가는 이미징 소프트웨어를 사용하여 멀티포인트 타임랩스 비디오를 개발하는 데 사용되었습니다.

M1 대식세포-4T1 마우스 유방 암암 세포에서 식세포 활동의 타임랩스 2D 이미징

여기서는 BSL-2 승인 마이코박테리움 결핵 증의 감쇠 체내 영상 프로토콜을 제시합니다. 영구 폐 창을 이용한 쥐 폐 내 스트레스. 이 접근법은 동일한 폐 미세환경 내에서 세균 위치, 혈관 역학, 대식세포 흡수 등 초기 숙주-병원체 상호작용의 종단적 단일 세포 분해 분석을 가능하게 합니다.

초기 혈관 내 감염 중 쥐 폐에서 희석된 위영양성 결핵 균의 생명체 내 영상

National Taiwan University Hospital.  This protocol describes a time-lapse live-cell imaging method to visualize antibody-dependent macrophage phagocytosis of green fluorescent protein–labeled triple-negative breast cancer cells using peripheral blood mononuclear cell–derived macrophages and an automated microscope.

녹색 형광 단백질로 표지된 삼중음성 유방암 세포의 항체 유도 대식세포 식작용에 대한 타임랩스 이미징

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