Name: 헥사메틸디실록산 촉진 확산 및 이온 선택성 전극 측정을 이용한 마우스 모델의 혈청, 뼈 및 치아 내 불소 정량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 학습하세요 마우스 혈청, 뼈, 치아에서 헥사메틸디실록산 촉진 확산 및 이온 선택성 전극을 이용한 불소 정량 분석 방법을. 이 민감하고 재현성 높은 기법은 소량 생물학적 표본에서 불소 측정을 가능하게 하여 노출, 대사 및 독성 연구를 지원합니다.

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본 출판물에 보고된 연구는 일본학술진흥회; JSPS 해외연구원 펠로우십 202560528 (S.Y.), 상파울루 주 연구지원재단 (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.), 그리고 미국 국립보건원 국립치과 및 두개안면연구소; R01DE027648 (M.S.) 및 K02DE029531 (M.S.)의 지원을 받았습니다.

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저자들은 이해관계의 충돌이 없음을 밝힙니다.

불소 측정은 란타넘 불화물(LaF₃) 결정 막이 포함된 불소 선택성 이온 선택 전극(ISE)을 사용하여 수행하였다38,39. 이 막은 매우 안정적인 La–F 결합을 형성하며, 그 결과 다른 할로겐화물보다 불소 이온에 대해 강한 선택성을 가진다. 확립된 전기화학 문헌 및 제조업체 사양에 따르면, LaF₃ 막은 염화물에 대해 매우 낮은 선택성 계수를 나타내며, 이는 본 프로토콜에서 사용된 조건하에서 염화물 이온이 측정 가능한 간섭을 일으키지 않음을 의미한다. 염화물은 치아와 뼈에 자연적으로 존재하지만, 그 활성은 전극 전위에 영향을 주지 않으며, 기록된 신호는 구체적으로 불소 활성만을 반영한다. 0.02 ppm의 하한 검출 한계는 Orion 불소 선택 전극에 대해 제조업체가 검증한 최소 정량 가능 농도에 해당한다. 이 한계는 전극이 안정적인 Nernstian 응답과 검정 곡선과의 선형 관계를 유지하는 최저 불소 농도를 나타낸다. 검출 한계는 전극 막의 특성에 의해 정의되고 제조업체에 의해 검증되었으므로 본 프로토콜을 위한 추가적인 실험적 결정은 필요하지 않았다. 다만, 상한 검출 범위와 관련하여, 저자들은 50&#160;µL NaOH 트랩 내 불소 질량이 약 38,000&#160;ng을 초과할 경우 전극 응답이 비선형적으로 나타나는 것을 관찰하였으며, 이는 매우 높은 불소 부하량에서는 검정 곡선을 더 이상 신뢰할 수 없음을 나타낸다. 이러한 비선형성은 ISE 자체의 고유한 상한선이라기보다, 주어진 실험 조건하에서 전극의 최적 이온 강도 및 활성 범위를 초과했기 때문일 가능성이 크다. 이 임계값 이상의 불소 질량이 포함될 것으로 예상되는 샘플의 경우, 전극의 선형 동적 범위 내에서 측정이 유지되도록 NaOH 트랩 부피를 늘리는 것이 권장된다.
불소 함량이 유난히 높은 샘플에 프로토콜을 적용할 때 이 점을 고려해야 합니다. 확산 단계에서 샘플 전체 부피가 소모되기 때문에, 생물학적 샘플에 대해 중복 측정 및 스파이크 회수(spike‑and‑recovery) 실험을 수행할 수 없었습니다. 분석의 정확도와 정밀도를 보장하기 위해, 기지의 불소 농도가 포함된 품질 관리(QC) 표준물을 모든 측정 시리즈에 포함하였습니다. 이러한 QC 표준물은 실험 샘플과 동일하게 처리 및 측정되었습니다. 모든 분석 과정에서 QC 표준물의 측정된 불소 농도는 예상 값의 5% 이내로 일정하게 유지되었습니다. 10~20개의 검체 샘플로 구성된 각 시리즈에 대해 5~6개의 교정 샘플로 이루어진 두 개의 독립적인 세트를 검체 샘플과 병행하여 준비하였으며, 매 측정 세션 전에 교정 곡선을 기록하였습니다. 교정 범위는 검체 유형, 확산 접시에 첨가된 물질의 질량, 동물의 처리군 및 연령에 따라 달라지는 검체 샘플의 예상 불소 질량에 근접하도록 각 분석마다 조정되었습니다. 혈청 측정의 경우, 교정 표준물은 검체 내 약 0.06–1.20 ppm의 불소 농도에 해당하였습니다. 뼈 및 치아 측정의 경우, 교정 표준물은 검체 내 약 19–7,600 ppm의 불소 농도에 해당하였습니다.
본 프로토콜은 hexamethyldisiloxane 촉진 확산 후 ISE 분석을 이용하여 혈청, 뼈 및 치아 내 불소 이온 질량을 정량화하는 민감하고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 이 방법은 다양한 생물학적 매질에서 방출된 불소를 안정적으로 포착하며, 통제된 노출 이후의 불소 축적량을 정량적으로 평가할 수 있게 합니다. 청소년기 및 성체 마우스의 대표적인 결과는 조직 전반에 걸쳐 불소 침착의 뚜렷한 연령 및 용량 의존적 차이를 보여주며, 이는 in vivo 불소 대사와 독성 동태학 연구에 있어 본 접근 방식의 유용성을 강조합니다.
이 프로토콜의 주요 장점은 불소 방출 반응과 불소 포집 환경을 물리적으로 분리하는 확산 접시(diffusion dish)를 사용한다는 점입니다. 페트롤라툼(petrolatum)으로 밀봉된 설계는 대기와의 교환을 최소화하며, 덮개 위에 놓인 수산화나트륨 액적에 의해 방출된 불소 이온이 효율적으로 포집되도록 보장합니다. HMDS로 포화된 황산은 뼈나 치아와 같이 고도로 석회화된 구조를 포함한 광물화 조직으로부터 불소가 방출되도록 강력하고 일관된 구동력을 제공합니다. 이후 확산 조건이 일치하는 표준물질로 보정한 ISE 측정법을 통해 넓은 동적 범위에서 정확한 정량이 가능합니다. 이 방법의 또 다른 장점은 매우 작은 생물학적 시료 내의 불소량을 정량할 수 있다는 것입니다. 마우스의 광물화 조직, 특히 하악 절치(mandibular incisors)는 치아당 회분(ash)이 3–5 mg에 불과합니다. 기존의 분석 방법들은 신뢰할 수 있는 검출을 위해 더 많은 시료 질량이나 더 높은 불소 함량이 필요한 경우가 많습니다. 반면, 확산 기반 설계는 전체 시료에서 방출된 모든 불소를 작고 정의된 부피 내로 농축시키므로, 절대적인 불소 질량이 낮은 매우 작은 시료에서도 정확한 정량이 가능합니다. 이러한 특징은 소형 동물 연구, 조직 가용성이 제한적인 경우 또는 미세 해부된 광물화 구조 연구에 특히 유용합니다.
본 방법의 주요 한계점은 본 연구에서 사용된 ISE의 검출 한계(0.02 ppm)입니다. 불소가 없는 대조군 동물의 혈청 샘플은 빈번하게 이 임계값보다 낮게 나타나, 극도로 낮은 불소 농도의 정량이 불가능했습니다. 검출 한계 근처 또는 그 이하의 미량 농도를 측정할 때는 가능하다면 확산 접시에 추가하는 시료의 질량이나 부피를 늘리거나, 대체 분석 기술이 필요할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 하룻밤 동안의 확산 과정과 부식성 시약의 세심한 취급이 필요하므로, 대량의 샘플을 처리하는 연구에서는 처리량이 제한될 수 있습니다. ISE는 전체적인 불소의 민감한 정량을 제공하지만, 조직 내의 공간적 분포는 평가할 수 없습니다. 미세 규모에서 거시 규모까지 불소 분포를 시각화하고 매핑하기 위해 에너지 분산형 X선 분광법을 결합한 주사 전자 현미경(SEM-EDX) 또는 입자 유도 감마선 방출(PIGE)과 같은 보완적인 접근 방식을 통합할 수 있습니다. 이러한 이미지 기반 방식은 무기질화 조직 또는 연조직 내의 국소적인 불소 축적 평가를 가능하게 하여, ISE 측정값을 보완하고 조직 내 불소 함량에 대한 보다 포괄적인 평가를 제공합니다.
본 프로토콜에서 불소 확산 및 측정의 정확도와 신뢰도에 영향을 줄 수 있는 몇 가지 반복적인 기술적 요인들이 있으며, 캘리브레이션 준비, 확산 접시 밀봉, pH 제어, 전극 성능 및 시료 취급이 종합적으로 데이터 품질을 결정한다는 점이 본 관찰 결과에서 강조되었습니다. 비선형 캘리브레이션 곡선(R2 &#60; 0.99) 또는 조직 시료 측정값이 예상 범위를 벗어난 경우, 확산 접시에 첨가한 NaF 스톡 용액 부피의 계산 착오나 검정 표준물질 조제 과정에서의 피펫팅 오류가 원인일 수 있습니다. 권장 조치: 각 분석 시마다 최소 두 세트의 독립적인 검정 시료를 준비하여, 하나의 검정 곡선이 예상 범위를 벗어날 경우 백업 세트를 사용할 수 있도록 합니다. 확산 접시의 밀봉이 불완전하면 확산 과정 중 불소 손실이 발생하여 측정값이 인위적으로 낮게 나올 수 있습니다. 이는 일반적으로 확산 접시 뚜껑 테두리에 바셀린(petrolatum)을 충분히 도포하지 않았을 때 발생합니다.. 권장 조치: 확산 접시 뚜껑의 가장자리를 따라 바세린(petrolatum jelly)을 충분히 바른 후, 완전히 밀봉되도록 단단히 누릅니다. NaOH 트랩에 아세트산 용액을 첨가할 때 피펫팅 오류가 발생하면 시료의 pH가 최적 범위인 pH 5.0을 벗어날 수 있으며, 이는 불소 회수율의 부정확함으로 이어질 수 있습니다. 권장 조치: pH 시험지로 각 시료의 pH를 확인하고, pH 5 범위를 벗어나는 시료는 폐기하십시오. 검정 시료 또한 불소 선택성 전극의 유효 측정 범위를 벗어날 수 있습니다. 0.02 ppm 미만의 농도는 전극의 검출 한계 미만입니다. 권장 조치: 0.02 ppm 미만의 불소 함유 검정 시료는 사용하지 마십시오. 반대로, 불소 농도가 지나치게 높은 검정 시료는 용액의 이온 강도를 변화시켜 전극의 비선형 응답을 유발할 수 있습니다. 권장 조치: 프로젝트 시작 시, 사용 중인 특정 전극의 선형 작동 범위를 결정하기 위해 넓은 불소 농도 범위의 검정 표준 용액을 준비하십시오. 조직 시료가 이 선형 범위를 초과하는 경우, 조직의 질량을 줄이거나 NaOH 트랩의 부피를 늘리고, pH 5를 유지하도록 이에 맞게 아세트산 부피를 조정하십시오. 0.02–1 ppm 범위에서 선형 검정 곡선을 얻기 어려운 경우: 일반적인 원인은 전극의 노후화입니다. 오래된 불소 선택성 전극은 매우 낮은 불소 농도에서 감도가 떨어집니다. 권장 조치: 불소 선택성 전극을 교체하십시오. 전위차계 읽기 값이 불안정한 경우(신호 표류 또는 도약)는 일반적으로 전극의 감지 표면이 시료 용액에 완전히 잠기지 않았을 때 발생합니다. 권장 조치: 감지 표면이 액체 시료에 완전히 덮이도록 전극을 낮추십시오.
전반적으로, 본 프로토콜은 다양한 생물학적 매질 내의 불소 함량을 정량화하기 위한 견고한 검정 기반 접근법을 제공하며, 마우스 모델에서 불소 노출, 조직 침착 및 독성학적 결과를 조사하는 연구에 매우 적합합니다.

불소는 자연적으로 발생하는 음이온이며, 적정 수준의 불소는 치아 우식증 예방에 효과적입니다1,2,3,4,5. 미국(U.S.)에서는 치아 우식증 발생률을 낮추고 구강 건강을 증진하기 위한 공중 보건 전략으로 0.7 ppm 농도의 지역사회 수돗물 불소화 사업을 시행해 왔습니다6. 그러나 과도한 불소를 장기간 섭취하면 여러 조직에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 고농도의 불소 노출은 법랑질 형성을 방해하고7,8,9, 골 형성을 변화시키며10, 골격의 무결성을 손상시킵니다11.
세포 수준에서 불소 노출은 산화 스트레스12, 소포체 스트레스13, 유전자 발현을 변화시키는 후성유전학적 변형14, 그리고 법랑질 형성 세포의 세포 사멸15,16,17,18을 포함한 여러 대사 장애를 유도합니다. 전 세계적으로 지하수의 높은 불소 농도(&gt;1.5 ppm)는 심각한 건강 문제를 야기합니다. 최근의 예측 모델링 연구에 따르면, 전 세계적으로 약 1억 8천만 명의 사람들이 과도한 불소 노출의 영향을 받을 가능성이 있으며, 특히 아시아와 아프리카에서 가장 큰 피해가 발생하는 것으로 추정되었습니다1. 식수 외에도 불소 노출은 식품(예: 해산물; ~1.9 ppm), 음료(예: 차; 0.5–6 ppm19), 그리고 치약과 같은 치과 제품20 (1,000–1,500 ppm)을 통해 발생합니다.
따라서 불소 노출, 대사 및 조직 침착을 이해하는 것은 불소의 치료적 이점과 잠재적인 독성학적 결과를 모두 평가하는 데 필수적입니다. 소변, 혈청, 뼈 및 치아를 포함한 생물학적 시료 내 불소의 정확한 정량 분석은 이 연구의 핵심 요소입니다. 그러나 불소의 화학적 성질과 칼슘이 풍부한 매질에 대한 강한 친화력으로 인해 측정 과정에서 분석적 어려움이 따릅니다. 체내 불소의 약 99%는 뼈와 치아 같은 무기질 조직에 존재합니다21. 이러한 과제를 해결하기 위해 이온 선택성 전극(ISE) 전위차 측정법, 이온 크로마토그래피, 비색법, 적정법, 그리고 핵 또는 활성화 기반 분석법을 포함한 다양한 분석 기술이 개발되었습니다22. 이 중에서 hexamethyldisiloxane(HMDS) 촉진 확산 기술과 불소 선택성 전극 측정법을 결합한 방식은 감도, 재현성 및 다양한 시료 유형과의 호환성 덕분에 생물학적 매질 분석에서 가장 신뢰할 수 있고 널리 사용되는 접근법 중 하나로 부상했습니다23,24,25,26,27,28,29.
다양한 분석법이 존재함에도 불구하고, 각 접근 방식은 실험적 또는 임상적 연구에서의 사용을 제한할 수 있는 한계점을 가지고 있습니다. 이온 크로마토그래피는 높은 민감도와 선택성을 제공하지만, 특수 장비와 광범위한 시료 전처리가 필요합니다30,31. SPADNS (sodium 2‑(parasulfophenylazo)‑1,8-dihydroxynaphthalene-3,6‑disulfonate) 법과 같은 비색 분석법은 간단하고 저렴하지만, 탁도 및 내인성 발색단의 간섭을 받기 쉬워 복잡한 생물학적 시료에서의 신뢰성이 제한적입니다22,32,33. 적정법은 비용 효율적이고 간단하지만, 대부분의 생물학적 표본에서 미량의 불소 검출에 필요한 민감도가 부족합니다34. 핵 또는 활성화 기반 기술은 탁월한 민감도를 제공하지만, 원자로 또는 가속기 기반 중성자원 접근이 필요하므로 일상적인 실험실 사용으로는 비실용적입니다35. 이와 대조적으로, HMDS 촉진 확산 후 ISE 측정법은 연조직과 무기질화 조직 모두에서 불소의 완전한 유리를 보장하는 동시에 민감도, 비용 및 접근성 사이의 실용적인 균형을 제공합니다. 이는 조직 확보가 제한적이고 생쥐 절치와 같은 무기질 구조에서 치아당 3–5 mg의 회분만이 생성되는 소동물 관련 연구에서 특히 유리합니다.
확산-ISE 방법은 방출된 모든 불소(fluoride)를 작고 정의된 부피로 농축할 수 있어 극소량의 시료에서도 정확한 정량이 가능합니다. 이러한 특성 덕분에 이 방법은 독성동태학 연구, 용량-반응 실험 및 발달 단계별 불소 대사 조사에 매우 적합합니다. 소형 설치류, 특히 C57BL/6J 마우스는 불소의 영향을 연구하기 위한 동물 모델로 널리 사용되어 왔습니다7,9,12,29,36.
본 프로토콜에서 저자들은 HMDS 촉진 확산 기술과 불소 선택성 전극 측정을 적용하여, 고농도 불소(125 ppm)에 노출된 마우스와 처리하지 않은 대조군으로부터 수집한 혈청, 뼈 및 치아 내의 불소량을 정량화합니다. 또한, 저자들은 청소년기(처치 시작 시 6주령)와 성숙기(처치 시작 시 18주령) 마우스의 불소 축적량을 비교하여 불소 대사 및 조직 침착의 연령별 차이를 평가합니다. 설치류의 절치(incisors)는 지속적으로 맹출하며 약 7주령까지 맹출과 교합 마모 사이의 정상 상태 균형을 이루기 때문에, 하악 절치를 대표적인 치아 조직으로 선정하였습니다. 이러한 지속적인 성장 패턴은 법랑질 발달의 일관되고 접근 가능한 구배를 제공하므로, 마우스 절치는 법랑질 형성 및 치아 불소증 연구를 위해 널리 사용되고 검증된 모델이 됩니다.

<table><tbody><tr><td>빙초산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Supelco, GR ACS</td><td>AX0073-6</td></tr><tr><td>알루미나 도가니</td><td>애드밸류 테크놀로지</td><td>외경 12 mm &amp;times; 25 mm H, AL-6212</td><td>AL-6212</td></tr><tr><td>분석용 저울</td><td>VWR</td><td>VWR 124B2, d = 0.1 mg</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>비드 비터(Bead Beater)</td><td>벤치마크</td><td>BeadBug 6</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>뭉툭한 팁 주사기 바늘</td><td>아마존</td><td>산업용 둔단 바늘, 14 G &amp;times; 0.5인치</td><td>X001TT8KX1</td></tr><tr><td>이산화탄소</td><td>AirGas</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>화학 흄후드</td><td>Mott Manufacturing</td><td>모델 7421040</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>D(+)-자당</td><td>Thermo Scientific</td><td>생화학을 위한 99.7%</td><td>177142500</td></tr><tr><td>전극 충전액</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion IonPlus 충전액</td><td>900061</td></tr><tr><td>에틸 알코올 용액</td><td>Koptec</td><td>140 Proof</td><td>2401</td></tr><tr><td>냉동고, &amp;minus;80 &amp;deg;C</td><td>Thermo Scientific</td><td>Revco RDE 시리즈</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>내열 장갑</td><td>Fisher Scientific</td><td>Bel-Art Clavies 생물학적 위험물 오토클레이브용 장갑</td><td>H13201</td></tr><tr><td>헥사메틸디실록산 (HMDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>TCI H0091, &gt;98%</td><td>H0091</td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>VWR</td><td>J.T. Baker, 30%</td><td>2204-01</td></tr><tr><td>이온 선택성 전극</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion 불소 이온 선택 전극(ISE), 2채널</td><td>9609BNWP</td></tr><tr><td>마그네틱 믹서</td><td>VWR</td><td>360 교반기</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>마이크로 스파출라</td><td>아마존</td><td>왁스 카빙 스파튤라 #7A, 스테인리스 스틸</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>마이크로원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td>5404000131</td></tr><tr><td>회화로</td><td>Thermo Scientific</td><td>Thermolyne 소형 벤치탑 머플 가열로, 1.3 L, FB1315M</td><td>FB1315M</td></tr><tr><td>오븐</td><td>Boekel Scientific</td><td>Boekel RapidFISH</td><td>240200</td></tr><tr><td>PBS 내 파라포름알데히드 용액</td><td>Thermo Scientific</td><td>PBS 내 4% 파라포름알데히드</td><td>J19943-K2</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>VWR</td><td>60 &amp;times; 15 mm, 미처리</td><td>25384-092</td></tr><tr><td>페트롤라툼</td><td>Thermo Scientific</td><td>정제 백색 페트롤라툼</td><td>417090010</td></tr><tr><td>pH 지시 종이</td><td>Fisher Scientific</td><td>pH-Fix 4.5&amp;ndash;10.0</td><td>92120.3</td></tr><tr><td>자기 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand 도가니, 5 mL, 높이 20 mm, 하이 폼(High Form)</td><td>FB-965-B</td></tr><tr><td>전위차계</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion Dual Star pH/ISE 미터</td><td>2115102</td></tr><tr><td>클램프가 장착된 링 스탠드</td><td>VWR</td><td>링 클램프, 15 cm</td><td>470104-526</td></tr><tr><td>설치류 사료</td><td>Bio-Serv</td><td>F1515, AIN-76A, &amp;frac12; 펠렛</td><td>F1515</td></tr><tr><td>시저 잭</td><td>아마존</td><td>실험실용 시저 잭</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>분별 깔때기</td><td>Fisher Scientific</td><td>Eisco, 붕규산 유리, 2 L</td><td>S89285</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>ACS 인증, 결정성</td><td>S271-1</td></tr><tr><td>플루오르화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>ACS 인증, 분말</td><td>S299-100</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>흰색 펠렛</td><td>BP359-500</td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 비드</td><td>Fisher Scientific</td><td>Scientific Industries, 5 mm, 100개입</td><td>SI-CS05</td></tr><tr><td>황산</td><td>Fisher Scientific</td><td>ACS 등급</td><td>A300-500</td></tr><tr><td>TISAB II</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion IonPlus 응용 솔루션</td><td>940909</td></tr><tr><td>진공 데시케이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>Bel-Art Space Saver 진공 데시케이터, 10인치</td><td>F42010-0000</td></tr><tr><td>진공 여과기</td><td>Fisher Scientific</td><td>플로우 보틀탑 필터, PES, 90 mm, 0.2 &amp;micro;m</td><td>597-4520</td></tr><tr><td>가변형 로커 (Variable Rocker)</td><td>중급 과학 (MidSci)</td><td>LabDoctor / Benchmark Scientific</td><td>&amp;mdash;</td></tr></tbody></table>

헥사메틸디실록산 촉진 확산 및 이온 선택성 전극 측정을 이용한 마우스 모델의 혈청, 뼈 및 치아 내 불소 정량 분석

Quantification of Fluoride in Serum, Bone, and Teeth in a Murine Model Using Hexamethyldisiloxane-Facilitated Diffusion and Ion-Selective Electrode Measurements

생체 조직 내 불소 농도를 정량화하는 것은 불소 노출, 대사 및 독성을 이해하는 데 필수적입니다. 본 프로토콜은 헥사메틸디실록산(HMDS) 촉진 확산 후 이온 선택성 전극(ISE) 분석을 사용하여 혈청, 뼈 및 치아의 불소 이온 질량을 측정하는 민감하고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 통제된 불소 처리에 노출된 마우스로부터 혈청, 대퇴골 및 하악 절치를 포함한 생체 시료를 수집합니다. 뼈와 치아 시료는 회화, 분쇄 및 수화 과정을 거치며, 혈청은 직접 처리합니다. 각 시료를 초순수가 담긴 확산 접시에 옮기고, 불소 트랩 역할을 하는 수산화나트륨 액적이 부착된 페트롤륨 라인 덮개로 밀봉합니다. HMDS로 포화된 황산을 주입하여 불소의 방출과 확산을 시작하며, 이를 통해 유리된 불소 이온이 트랩에 정량적으로 포집됩니다. 밤샘 확산 후, 불소 트랩 액적들을 하나의 시료로 합치고, 필요한 pH 범위로 산성화하며, ISE 측정을 위해 정의된 부피로 조정합니다. 알려진 불소 질량으로 준비된 교정 확산 접시를 통해 정량을 위한 표준 곡선을 생성하며, 품질 관리 시료로 전극의 안정성을 검증합니다. 0 또는 125 ppm 불소에 노출된 청소년 및 성체 마우스의 대표적인 결과는 혈청, 뼈 및 치아 전체에서 연령 및 용량 의존적인 불소 농도 차이를 검출하는 본 방법의 능력을 보여줍니다. 본 프로토콜은 다양한 생체 매질 내의 불소를 정량화하기 위한 견고한 교정 기반 접근 방식을 제공하며, 마우스 모델에서의 불소 노출, 조직 침착 및 독성학적 결과를 조사하는 연구에 적합합니다. 이 방법의 주요 장점은 확산 과정이 방출된 모든 불소를 100&#160;µL 미만의 측정 가능한 시료 부피로 농축시키기 때문에, 개별 마우스 절치에서 얻은 3–5 mg의 회분과 같이 극소량의 시료에서도 불소를 정확하게 정량할 수 있다는 점입니다.

생체 시료 내 불소(F-) 농도 측정을 위한 본 프로토콜의 적용 사례를 보여주기 위해, 제어된 불소 처리 조건에 노출된 마우스에서 수집한 혈청, 뼈 및 하악 절치 시료로부터 검체를 제작하였다. 수컷 C57BL/6J 마우스를 청소년기(6주령)와 성숙기(18주령)의 두 연령 그룹으로 나누고, 6주간의 노출 기간 동안 불소가 없는 탈이온수(0 ppm F⁻) 또는 불화나트륨이 첨가된 식수(125 ppm F⁻)를 제공하였다. 각 연령 및 처리 조건당 5마리의 동물을 포함하였다. 노출 기간 종료 후 혈청, 대퇴골 및 하악 절치를 채취하였으며, 프로토콜에 따라 검체를 준비하고 분석하였다. 혈청, 뼈 및 치아에서 측정된 대표적인 불소 농도를 아래에 요약하였다.
<img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71488/71488fig4.jpg" /> 
그림 4혈청, 대퇴골 및 하악 절치에서 측정된 불소 농도. 수컷 C57BL/6J 마우스를 청소년기(6주령, 빈 막대)와 성체기(18주령, 채워진 막대)의 두 연령 그룹으로 나누어, 불소가 없는 탈이온수(0 ppm F)를 제공하거나&#8315;) 또는 불소나트륨이 첨가된 음용수 (125 ppm F&#8315;)로 6주 동안 노출시켰다. 노출 기간이 종료된 후, 동일한 처리군으로부터 (A) 혈청, (B) 대퇴골 및 (C) 하악 절치에서 불소 농도를 측정하였다. 검출 한계 미만의 혈청 값(&#60;0.02 ppm)은 시각화를 위해 도식화하였으나 통계 분석에서는 제외하였다. 데이터는 평균값으로 표기하였다. &#177; 표준편차 청소년 집단과 성인 집단 간의 비교는 다중 비교를 위한 Bonferroni-Dunn 교정을 적용한 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 수행되었습니다. *p &#60; 0.05, **p &#60; 0.01 (그룹당 N = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71488/71488fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
혈청 내 불소 농도 
0 ppm 불소 처리군에서는 청소년군과 성체군 모두 혈청 불소 농도가 이온 선택성 전극의 검출 한계(&#60;0.02 ppm) 미만이었습니다. 125 ppm 처리군에서 혈청 불소 농도는 청소년군에서 0.3 ± 0.2 ppm으로, 성체군에서는 0.7 ± 0.2 ppm으로 증가하였습니다 (p = 0.06).125 ppm 처리 청소년군과 성체군 간의 비교는 다중 비교를 위한 Bonferroni–Dunn 보정을 적용한 Mann–Whitney U 검정을 사용하여 수행되었습니다. *p &#60; 0.05, **p &#60; 0.01 (N = 5/group). 0 ppm 처리군은 통계 분석에서 제외되었습니다. (그림 4A, 표 1).
대퇴골 내 불소 농도 
0 ppm 처리군에서 대퇴골 불소 농도는 성체 동물(896 ± 55 ppm)에 비해 청소년기 동물(292 ± 39 ppm)에서 유의하게 낮았습니다 (p &#60; 0.01). 반면, 125 ppm 처리군에서는 청소년기 동물의 불소 농도(4,108 ± 482 ppm)가 성체 동물(2,966 ± 612 ppm)보다 유의하게 높았습니다 (p = 0.04). 청소년기 군과 성체 군 간의 비교는 다중 비교를 위한 Bonferroni–Dunn 보정을 적용한 Mann–Whitney U 검정을 사용하여 수행되었습니다. *p &#60; 0.05, **p &#60; 0.01 (N = 5/군). (그림 4B, 표 1). 그림 5A는 각 연령군에 대해 0 ppm과 125 ppm 처리 간의 대퇴골 불소 농도 배수 변화를 보여줍니다. 청소년기 동물은 125 ppm에서 불소 수치가 14배 증가한 반면, 성체 마우스는 3배 증가했습니다.
하악 절치의 불소 농도 
0 ppm 군에서 하악 절치의 불소 농도는 성체 동물(123 ± 23 ppm)에 비해 청소년기 동물(35 ± 4 ppm)에서 유의하게 낮았습니다 (p = 0.03). 125 ppm 처리군에서 절치 불소 농도는 청소년기 동물의 경우 5641 ± 955 ppm으로, 성체 동물의 경우 4392 ± 1694 ppm으로 증가했습니다. 청소년기 군과 성체 군 간의 비교는 다중 비교를 위한 Bonferroni–Dunn 보정을 적용한 Mann–Whitney U 검정을 사용하여 수행되었습니다. *p &#60; 0.05, **p &#60; 0.01 (N = 5/군). (그림 4C, 표 1). 125 ppm에서의 절대 불소 농도는 연령군 간에 유의미한 차이가 없었으나, 0 ppm에서 125 ppm으로의 배수 변화(fold-change)는 성체 생쥐(36배 증가)보다 청소년기 생쥐(161배 증가)에서 유의하게 더 컸습니다 (그림 5B).
<img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71488/71488fig5.jpg" /> 
그림 5: 청소년기 쥐는 성체 쥐보다 뼈와 절치에서의 불소 축적 배수 증가율이 더 높게 나타난다. 청소년기 쥐(빈 막대)와 성체 쥐(채워진 막대)에서 0 ppm에서 125 ppm 불소 처리 시 불소 농도의 배수 변화. (A) 동일 처리군의 대퇴골 및 (B) 하악 절치. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다. 청소년기 그룹과 성체 그룹 간의 비교는 unpaired t-test를 사용하여 수행되었다. * p &#60; 0.05, (N = 5/group). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71488/71488fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>시료</td>
			<td colspan="4">혈청</td>
			<td colspan="4">대퇴골</td>
			<td colspan="4">하악 중절치</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>연령대</td>
			<td colspan="2">청소년</td>
			<td colspan="2">성숙한</td>
			<td colspan="2">청소년</td>
			<td colspan="2">성숙한</td>
			<td colspan="2">청소년</td>
			<td colspan="2">성숙한</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>처리군</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm&#160;</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm&#160;</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.2</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.8</td>
			<td>324</td>
			<td>4576</td>
			<td>933</td>
			<td>3081</td>
			<td>37</td>
			<td>4824</td>
			<td>161</td>
			<td>3229</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.1</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.8</td>
			<td>229</td>
			<td>3778</td>
			<td>924</td>
			<td>3326</td>
			<td>39</td>
			<td>5451</td>
			<td>127</td>
			<td>2654</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.7</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>1.0</td>
			<td>300</td>
			<td>4683</td>
			<td>877</td>
			<td>3713</td>
			<td>31</td>
			<td>5544</td>
			<td>112</td>
			<td>6997</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.4</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.5</td>
			<td>323</td>
			<td>3832</td>
			<td>807</td>
			<td>2519</td>
			<td>35</td>
			<td>5114</td>
			<td>103</td>
			<td>4169</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.3</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.5</td>
			<td>283</td>
			<td>3669</td>
			<td>937</td>
			<td>2192</td>
			<td>제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.</td>
			<td>7271</td>
			<td>111</td>
			<td>4909</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>평균</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.3</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.7</td>
			<td>292</td>
			<td>4108</td>
			<td>896</td>
			<td>2966</td>
			<td>35</td>
			<td>5641</td>
			<td>123</td>
			<td>4392</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>표준편차</td>
			<td>해당 내용이 제공되지 않았습니다. 번역할 원문 텍스트를 입력해 주세요.</td>
			<td>0.2</td>
			<td>제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.</td>
			<td>0.2</td>
			<td>39</td>
			<td>482</td>
			<td>55</td>
			<td>612</td>
			<td>3</td>
			<td>955</td>
			<td>23</td>
			<td>1694</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 혈청, 대퇴골 및 하악 절치에서의 개별 불소 측정값. 표 1은 0 ppm 또는 125 ppm의 불소에 노출된 청소년기 및 성체 마우스의 혈청, 대퇴골 및 하악 절치 시료에서 측정된 개별 불소 농도(ppm F⁻)를 나타냅니다. 각 조직 유형에 대해 데이터는 청소년기 0 ppm, 청소년기 125 ppm, 성체 0 ppm, 성체 125 ppm의 네 가지 처리 그룹에 해당하는 열로 제시됩니다. 각 열에는 기록된 5개의 개별 값(N = 5)과 이어서 계산된 평균 및 표준편차(SD)가 포함됩니다. 청소년기 0 ppm 혈청 그룹의 경우, 모든 기록된 값은 이온 선택성 전극의 검출 한계(&#60;0.02 ppm) 미만이었습니다. 이 표는 그림 4에 제시된 요약 값 및 통계적 비교의 근거가 되는 가공되지 않은 수치 데이터를 제공합니다.

본 프로토콜에서는 헥사메틸디실록산(HMDS)을 이용한 확산 접시 준비 방법과, 이후 이온 선택성 전극 측정을 통해 마우스의 혈청, 뼈 및 치아 내 불소 이온 질량을 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 생물학적 시료 내의 불소 축적도를 평가하기 위해 검정 곡선을 기반으로 하는 민감한 접근 방식을 제공합니다.

생체 조직 내 불소 농도를 정량화하는 것은 불소 노출, 대사 및 독성을 이해하는 데 필수적입니다. 본 프로토콜에서는 ...

본 연구는 불소 처리된 마우스의 혈청, 뼈 및 치아 내 불소 농도를 정량화하는 데 중점을 둡니다. 기존 방법들은 대량의 시료나 고가의 장비가 필요합니다. 본 프로토콜은 마이크로리터(µL) 또는 밀리그램(mg) 단위의 시료에서 불소를 측정합니다.먼저, 불소화 나트륨이 첨가된 음용수 또는 불소가 없는 음용수를 섭취한 청소년기 및 성체 C57BL/6J 생쥐의 다리 뼈를 적출합니다. 건조 후, 뼈를 알루미나 도가니에 옮긴 다음, 시간당 150 °C의 승온 속도로 600 °C의 회화로에서 6시간 동안 회화시킵니다.깨끗한 표면 위에 처리되지 않은 60x15mm 페트리 접시를 놓습니다. 가열된 18-gauge 주사 바늘을 사용하여 페트리 접시 뚜껑에 작은 구멍을 뚫습니다. 다음으로, 뭉툭한 14-gauge 바늘이 장착된 10 mL 주사기를 사용하여 페트리 접시 뚜껑의 안쪽 가장자리를 페트롤라툼으로 연속적으로 밀봉하여 코팅합니다. 마이크로 스패튤라를 사용하여 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 내의 소각된 뼈를 미세한 분말로 갈아내고, 분쇄된 골분을 즉시 처리합니다. 골분이 오염된 소모품은 기관의 화학 폐기물 처리 경로를 통해 폐기하십시오. 정전기를 최소화하고 분말 비산을 방지하기 위해 분쇄된 골분을 작은 자기 접시로 옮깁니다. 다음으로, 가독성이 최소 0.1 mg인 분석 저울 위에 빈 페트리 접시 바닥을 올립니다. 마이크로 스패튤라를 사용하여 골분 약 5 mg을 추가하고 정확한 무게를 기록합니다. 무게를 측정한 골분에 즉시 3 mL의 초순수를 가하여 덮어줍니다.불소 트랩을 형성하기 위해 0.05 normal 수산화나트륨 50 µL를 페트리 접시 뚜껑의 안쪽 표면, 가장자리에서 떨어진 곳에 세 방울로 나누어 첨가합니다. 수산화나트륨 방울이 흐트러지지 않도록 주의하며 페트리 접시 뚜껑을 뒤집습니다. 바세린(petrolatum)을 사용하여 뚜껑을 페트리 접시 바닥에 밀봉합니다. 6 normal HMDS-포화 황산과 초순수를 동일한 부피로 혼합하여 3 normal HMDS-포화 황산 용액을 준비합니다. 준비된 용액 3 mL를 20-gauge 바늘이 장착된 10 mL 주사기에 즉시 충전합니다. 뚜껑의 구멍을 통해 용액을 확산 접시 바닥의 물 속으로 주입합니다. 산이 뚜껑 안쪽 표면에 튀지 않도록 주의하며 바늘을 천천히 뽑아냅니다. 주입 구멍을 바세린으로 빠르게 완전히 밀봉합니다. 확산 접시를 저속으로 설정된 가변 로커(variable rocker) 위에 놓고 실온에서 하룻밤 동안 배양합니다.측정을 시작하기 전에, 충전된 이온 선택성 전극을 홀더에 설치하고 전위계에 연결하십시오. 전극의 감지 표면 아래 시저 잭 위에 처리되지 않은 페트리 접시를 배치하고, 감지 표면이 접시 바닥과 평행하도록 맞추십시오. 페트리 접시가 전극에 거의 닿을 때까지 시저 잭의 테이블을 올리십시오. 배양 기간이 끝난 후, 로커에서 확산 접시를 제거하십시오. 페트롤라툼 씰을 제거하여 덮개를 조심스럽게 들어 올리십시오. 그런 다음, 세 개의 불소 트랩 방울이 흐트러지지 않도록 덮개를 평평한 표면에 뒤집어 놓으십시오. 다음으로 P20 피펫을 사용하여 0.2 normal 아세트산을 15~20 µL 불소 트랩 방울 중 하나에 첨가하고, 피펫 팁을 교체하지 않은 상태에서 세 방울을 모두 하나의 방울로 합치십시오. 합쳐진 시료를 뒤집힌 덮개 위에 그대로 두십시오. P100 피펫을 75 µL로 설정하십시오. 공기가 들어가지 않도록 불소 트랩의 전체 부피를 흡입하고, 초순수를 사용하여 시료 부피를 정확히 75 µL로 조정하십시오. 즉시 측정을 진행하십시오. 불소 선택성 전극의 감지 표면과 페트리 접시 사이에 시료를 분주하십시오. 감지 표면 전체가 페트리 접시에 닿지 않은 상태에서 액체에 잠기도록 하십시오. 수치가 안정될 때까지 기다린 후, 전위계 디스플레이에서 전극 전위를 mV 단위로 기록하십시오.불소가 없는 식수를 제공받은 생쥐의 경우, 청소년기 생쥐의 일시적인 불소 농도는 성체 생쥐보다 유의하게 낮았습니다. 이와 반대로, 125 ppm의 불소에 노출되었을 때는 이 패턴이 역전되어 청소년기 생쥐의 대퇴골 불소 농도가 성체 생쥐보다 유의하게 높게 나타났습니다. 불소 노출 후 청소년기 생쥐는 대퇴골 불소 농도가 14배 증가한 반면, 성체 생쥐는 3배의 더 낮은 증가 폭을 보였습니다.본 프로토콜은 매우 적은 시료 부피에서도 혈청 및 석회화 조직 내의 불소 농도를 정확하게 측정합니다. 정밀하게 측정된 회분이 확산 접시로 완전히 옮겨지는 것이 매우 중요하며, 소실이 발생할 경우 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 향후 연구에서 이 접근법을 통해 불소 축적이 조직 건강, 질병 위험 및 노화에 어떤 영향을 미치는지 밝혀낼 수 있기를 바랍니다.

quantification-fluoride-serum-bone-teeth-murine-model-using

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여기서 설명하는 낭포 성 섬유증에 결함이 클로라이드 채널에 대한 활성을 유지 정제 야생형 및 돌연변이 CFTR 단백질의 기능적 재구성을위한 신속하고 효율적인 절차이다. CFTR 의해 매개 재구성 테오에서 요오드화 유출 채널 활성의 연구 및 작은 분자의 효과를 허용한다.

정제 된 야생형과 돌연변이 체 CFTR 단백질의 기능의 재구성 및 채널 활동 측정

세포막의 수송체는 세포막 또는 세포층을 가로질러 이온을 차등적으로 분리할 수 있으며 조직 생리학, 복구 및 병리학에서 중요한 역할을 합니다. 우리는 생체 내에서 단일 세포 및 조직에서 특정 이온 플럭스를 측정할 수 있는 이온 선택적 자체 참조 미세전극에 대해 설명합니다.

이온 선택적 자체 참조 미세 전극 기술을 이용하여 세포 외 이온 플럭스 측정

핵막 단백질은 많은 기본적인 생물학적 과정에서 중심적인 역할을 하며 다양한 인간 질병과 관련이 있습니다.  이 프로토콜은 LINC 복합체 파괴의 시공간 제어를 허용하는 새로운 Cre/Lox 기반 마우스 모델을 설명합니다.

마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해

Immunohistochemistry는 조직 내 단백질 국소화 및 발현을 평가하기 위한 강력한 실험실 기술입니다. 현재의 반자동 정량 분석 방법은 주관성을 도입하고 종종 재현성 없는 결과를 생성합니다. 여기에서는 다중 스펙트럼 이미징을 사용하여 multiplexed immunohistochemistry 및 단백질 발현 및 공동 국소화의 객관적인 정량화를 위한 방법을 설명합니다.

멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

유체 전단의 다양한 수준과 패턴은 내피 유전자 발현, 표현형 및 질병에 대한 감수성을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 우리는 '전단 고리'의 조립과 사용에 대해 논의합니다: 단방향, 주기적인 전단 응력 패턴을 생성하는 모델입니다. 전단 링은 조립이 간단하고 경제적이며 높은 세포 수율을 생성할 수 있습니다.

총회와 &#39;전단 반지&#39;의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델

여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 "튜브" 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

여기에 설명된 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱 및 자유롭게 사용할 수 있는 도구를 사용하여 분석하는 미생물군유전체 프로파일링을 위한 간소화된 표준 작동 절차입니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야를 새로운 연구자뿐만 아니라 더 높은 해상도에서 박테리아 프로파일링을 달성하기 위한 방법에 대한 업데이트를 요구하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

여기서, 우리는 선충 C. 예쁜꼬마선충에서 세포 단백질 독성 스트레스 반응을 형광 전사 기의 활성화를 측정하고 생리적 스트레스에 대한 감수성을 측정하여 특성화한다.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

학습하세요 마우스 혈청, 뼈, 치아에서 헥사메틸디실록산 촉진 확산 및 이온 선택성 전극을 이용한 불소 정량 분석 방법을. 이 민감하고 재현성 높은 기법은 소량 생물학적 표본에서 불소 측정을 가능하게 하여 노출, 대사 및 독성 연구를 지원합니다.

헥사메틸디실록산 촉진 확산 및 이온 선택성 전극 측정을 이용한 마우스 모델의 혈청, 뼈 및 치아 내 불소 정량 분석

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