Name: 균류의 종 간 상호작용 중 형태측정학적 연구를 위한 비접촉식 공동 배양 분석법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 배우세요 균류의 종 간 상호작용을 연구하는 비접촉식 공동 배양 분석법을 활용한 형태측정학적 연구 방법을. 막 삽입 웰 플레이트 및 세포 무상청액 기반 분석법으로 미생물 형태 변화를 정량적으로 측정할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

본 연구는 RNP에게 수여된 DBT-Wellcome Trust India Alliance Intermediate Fellowship (IA/I/19/1/504294)의 지원을 받았습니다. KBSS는 Ahmedabad University Special Research Grant (AU/SRG/SAS/20-21/07_KS_03.25) 및 SERB-Core Research Grant (URBSASE23A6/SERB/23-24/KS_02.27)의 지원을 받았습니다. 그림 1에 사용된 아이콘은 CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) 라이선스 하의 Servier Medical Art (https://smart.servier.com/)와 BioArt Source, NIAID, NIH에서 수정하여 사용하였습니다.

<ol>
	<li>Peleg AY, Hogan DA, Mylonakis E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat Rev Microbiol. 2010;8(5):340-349.</li>
	<li>Waters CM, Bassler BL. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu Rev Cell Dev Biol. 2005;21:319-346.</li>
	<li>Foster KR, Bell T. Competition, not cooperation, dominates interactions among culturable microbial species. Curr Biol. 2012;22(19):1845-1850.</li>
	<li>Carolus H, Van Dyck K, Van Dijck P. Candida albicans and Staphylococcus species: a threatening twosome. Front Microbiol. 2019;10:2162.</li>
	<li>Pasman R, et al. Candida albicans and Staphylococcus aureus reciprocally promote their virulence factor secretion and pro-inflammatory effects. Front Cell Infect Microbiol. 2025;15:1629373.</li>
	<li>Grandcl&#233;ment C, Tanni&#232;res M, Mor&#233;ra S, Dessaux Y, Faure D. Quorum quenching: role in nature and applied developments. FEMS Microbiol Rev. 2016;40(1):86-116.</li>
	<li>Goers L, Freemont P, Polizzi KM. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. J R Soc Interface. 2014;11(96):20140065.</li>
	<li>Burmeister A, Gr&#252;nberger A. Microfluidic cultivation and analysis tools for interaction studies of microbial co-cultures. Curr Opin Biotechnol. 2020;62:106-115.</li>
	<li>Kapoore RV, Padmaperuma G, Maneein S, Vaidyanathan S. Co-culturing microbial consortia: approaches for applications in biomanufacturing and bioprocessing. Crit Rev Biotechnol. 2022;42(1):46-72.</li>
	<li>Kalluri R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 2016;16(9):582-598.</li>
	<li>Deveau A, et al. Bacterial-fungal interactions: ecology, mechanisms and challenges. FEMS Microbiol Rev. 2018;42(3):335-352.</li>
	<li>Temkin MI, Carlson CM, Stubbendieck AL, Currie CR, Stubbendieck RM. High throughput co-culture assays for the investigation of microbial interactions. J Vis Exp. 2019;(152). doi:10.3791/60275.</li>
	<li>Cecchelli R, et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 2014;9(6):e99733.</li>
	<li>Wodzanowski KA, Cassel SE, Grimes CL, Kloxin AM. Tools for probing host-bacteria interactions in the gut microenvironment: from molecular to cellular levels. Bioorg Med Chem Lett. 2020;30(10):127116.</li>
	<li>Luo Y, McAuley DF, Fulton CR, Pessoa JS, McMullan R, Lundy FT. Targeting Candida albicans in dual-species biofilms with antifungal treatment reduces Staphylococcus aureus and MRSA in vitro. PLoS One. 2021;16(4):e0249547.</li>
	<li>Justus CR, Marie MA, Sanderlin EJ, Yang LV. Transwell in vitro cell migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 2023;2644:349-359.</li>
	<li>McCarty NS, Ledesma-Amaro R. Synthetic biology tools to engineer microbial communities for biotechnology. Trends Biotechnol. 2019;37(2):181-197.</li>
	<li>Virgo M, Mostowy S, Ho BT. Emerging models to study competitive interactions within bacterial communities. Trends Microbiol. 2025;33(6):688-700.</li>
	<li>Moutinho TJ, Panagides JC, Biggs MB, Medlock GL, Kolling GL, Papin JA. Novel co-culture plate enables growth dynamic-based assessment of contact-independent microbial interactions. PLoS One. 2017;12(8):e0182163.</li>
	<li>Gnecchi M, Zhang Z, Ni A, Dzau VJ. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 2008;103(11):1204-1219.</li>
	<li>Hogan DA, Vik &#197;, Kolter R. A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology. Mol Microbiol. 2004;54(5):1212-1223.</li>
	<li>Poon Y, Hui M. Inhibitory effect of lactobacilli supernatants on biofilm and filamentation of Candida albicans, Candida tropicalis, and Candida parapsilosis. Front Microbiol. 2023;14. doi:10.3389/fmicb.2023.1105949.</li>
	<li>Huh D, Matthews BD, Mammoto A, Montoya-Zavala M, Hsin HY, Ingber DE. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 2010;328(5986):1662-1668.</li>
	<li>Huh D, et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 2013;8(11):2135-2157.</li>
	<li>Bhatia SN, Ingber DE. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 2014;32(8):760-772.</li>
	<li>Itani A, Shida Y, Ogasawara W. A microfluidic device for simultaneous detection of enzyme secretion and elongation of a single hypha. Front Microbiol. 2023;14:1125760.</li>
	<li>Beneyton T, Thomas S, Griffiths AD, Nicaud JM, Drevelle A, Rossignol T. Droplet-based microfluidic high-throughput screening of heterologous enzymes secreted by the yeast Yarrowia lipolytica. Microb Cell Fact. 2017;16:18.</li>
	<li>Xu XL, et al. Bacterial peptidoglycan triggers Candida albicans hyphal growth by directly activating the adenylyl cyclase Cyr1p. Cell Host Microbe. 2008;4(1):28-39.</li>
	<li>Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) medium (liquid or solid). Cold Spring Harb Protoc. 2017;2017(8):pdb.rec090563.</li>
	<li>Parnandi VA, Trivedi PM, Panchal H, Suryawanshi G, Patkar RN. A small Candida glabrata protein promotes hyphal growth in C. albicans during mixed-species invasive candidiasis. Curr Biol. 2026;36(1):1-15.e9.</li>
	<li>Davis-Hanna A, Piispanen AE, Stateva LI, Hogan DA. Farnesol and dodecanol effects on the Candida albicans Ras1-cAMP signalling pathway and the regulation of morphogenesis. Mol Microbiol. 2008;67(1):47-62.</li>
	<li>Polke M, et al. A functional link between hyphal maintenance and quorum sensing in Candida albicans. Mol Microbiol. 2017;103(4):595-617.</li>
	<li>Su C, Yu J, Sun Q, Liu Q, Lu Y. Hyphal induction under the condition without inoculation in Candida albicans is triggered by Brg1-mediated removal of NRG1 inhibition. Mol Microbiol. 2018;108(4):410-423.</li>
	<li>Senesi N, Wilkinson KJ. Biophysical Chemistry of Fractal Structures and Processes in Environmental Systems. Chichester: John Wiley &#38; Sons; 2008: ISBN: 978-0-470-01474-5.</li>
	<li>Bayry J, Aimanianda V, Guijarro JI, Sunde M, Latg&#233; JP. Hydrophobins&#8212;unique fungal proteins. PLoS Pathog. 2012;8(5):e1002700.</li>
	<li>Ojkic N, Serbanescu D, Banerjee S. Surface-to-volume scaling and aspect ratio preservation in rod-shaped bacteria. eLife. 2019;8:e47033.</li>
	<li>Li X, de Souza RA, Heinemann M. The rate of glucose metabolism sets the cell morphology across yeast strains and species. Curr Biol. 2025;35(4):788-798.e4.</li>
	<li>Mochizuki S, Minami E, Nishizawa Y. Live-cell imaging of rice cytological changes reveals the importance of host vacuole maintenance for biotrophic invasion by blast fungus, Magnaporthe oryzae. MicrobiologyOpen. 2015;4(6):952-966.</li>
	<li>Fernandez J, Orth K. Rise of a cereal killer: the biology of Magnaporthe oryzae biotrophic growth. Trends Microbiol. 2018;26(7):582-597.</li>
	<li>Wengler MR, Talbot NJ. Mechanisms of regulated cell death during plant infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Cell Death Differ. 2025;32(5):793-801.</li>
</ol>

저자들은 경쟁 관계나 이해 상충 관계가 없음을 선언합니다.

멤브레인 인서트 웰 플레이트와 CFS 기반 분석법을 사용한 이전 보고에 따르면, C. albicans는 C. glabrata 세포 또는 그 CFS에 반응하여 균사를 형성하는 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 반응은 Saccharomyces cerevisiae 및 Candida dubliniensis와 같은 다른 효모들에 의해서는 유도되지 않았습니다30. 또한, 이러한 균사 반응은 C. albicans SC5314 실험실 표준 균주에만 국한되지 않고, 임상 분리주 WUM5A를 포함한 다른 유전적 배경에서도 발생했습니다30. 본 프로토콜에서는 이러한 발견을 바탕으로 균사 길이, 균사 부피, 균사 두께라는 세 가지 형태학적 지표를 정량화하기 위한 표준화된 워크플로우를 구축했습니다. 나아가, 이러한 형태학적 요인들을 사용하여 배양액 분비 유도 분자에 반응하는 C. albicans의 형태적 특성에 배수성 및 접합형 유전자좌 상태의 변이가 어떠한 영향을 미치는지 평가하였습니다.
여기에서 설명하는 비접촉식 방법론은 가용성 종 간 신호 전달 인자의 형태 측정 결과를 시각화하고 분석하기 위한 간단한 실험적 프레임워크를 제공합니다. 멤브레인 인서트 웰 플레이트는 활성 배양물 간의 양방향 확산을 가능하게 하는 반면, CFS 기반 분석법은 필요한 유도 성분을 하위 표적 배양물과 독립적으로 수집하기 때문에 확장 가능한 포맷을 제공합니다. 분석의 일관성을 위해서는 멤브레인 인서트 웰 플레이트 설정에서 약 1:50 (C. albicans 대 C. glabrata)의 비율을 유지하는 것이 필요합니다. 이러한 농도 기울기는 멤브레인 장벽을 통해 가용성 유도 분자의 적절한 흐름을 보장하는 동시에, C. albicans의 필라멘트 형성 역학을 억제할 수 있는 farnesol과 같은 내인성 쿼럼 센싱 억제제의 축적 임계값 미만으로 유지시켜 줍니다31,32. 이와 유사하게, CFS 기반 분석에서 중요한 단계는 C. glabrata 소스 배양물이 균일하게 후기 정지 성장기에 도달하는 데 필요한 18시간의 배양 기간입니다. C. glabrata 배양 기간이 12시간 미만이거나 24시간을 초과하는 경우, 수집된 CFS가 본 연구에서 다룬 특정 유도 분자의 최적 농도를 가질 가능성이 낮아져 균사 유도가 최적화되지 않을 수 있습니다. CFS를 수집하기 위한 적절한 성장 단계나 배양물 비율은 새로운 실험 목적 및/또는 새로운 미생물 종의 조합에 대해 표준화되어야 합니다.
다양한 실험실 환경에서 분석 재현성을 최대화하기 위해 다음과 같은 주요 절차적 개선 사항을 권장합니다. 모든 이배체 C. albicans 균주의 하룻밤 배양에는 Glucose Minimal Medium (GMM) 사용을 권장합니다. GMM을 사용하면 영양이 풍부한 YPD 배지에서 빈번하게 관찰되는 배경 자동균사형성(auto-filamentation)을 억제할 수 있습니다. 이러한 자동균사형성은 다른 연구에서도 관찰되었으나, 그 근본적인 기전은 여전히 불분명합니다33. 또한 고배율 명시야 현미경 관찰 시 방해가 될 수 있는 빛 산란 및 광학 수차를 제거하기 위해, 이미지 획득 전에 폴리카보네이트 멤브레인 인서트를 완전히 물리적으로 제거할 것을 권장합니다.
이러한 비접촉식 구성은 가용성 신호 전달 성분의 역할을 구분하는 데 도움이 되지만, 특정한 실험적 어려움이 수반됩니다. 예를 들어, 비접촉식 분석법은 부주의한 취급으로 인한 막 파열과 그로 인한 미생물 교차 오염과 같은 사소한 위험에 노출되기 쉽습니다. 따라서 샘플링 시 피펫 팁이 막이 아닌 인서트의 챔버 벽면에 닿도록 주의하여 팁을 배치해야 합니다. 또한, 부적절한(더 큰) 공극 크기로 인해 구획 간에 물리적 교차 오염이 발생할 수 있으며, 이는 적절한 막 공극 크기를 가진 인서트를 사용하여 쉽게 해결할 수 있습니다. 진균의 과성장이나 광범위한 바이오필름 증착이 다공성 막을 덮을 수 있는데, 이는 초기 접종 농도를 OD600 = 0.1로 제한하고 12 h 이상 배양하지 않음으로써 해결할 수 있습니다. 추가적으로, 미생물이 장치 웰 내에서 균일하게 분포하지 않고 종종 막 근처에 응집되거나 부착될 수 있으며, 이는 광학 밀도 측정에서 예상치 못한 편향을 초래할 수 있습니다. 더욱이, 이러한 시스템은 두 개체군을 물리적으로 분리하기 때문에 세포 간의 직접적인 물리적 접촉에 의존하는 상호작용을 재현하거나 평가할 수 없습니다. 예를 들어, 혼합 종 바이오필름의 성숙, 기계적 공동 응집, 또는 세포벽 부착소(adhesins)에 의해 유도되는 신호 전달 등이 이에 해당합니다. 이러한 플레이트 기반 분석법은 초기 필라멘트 형성 역학(3 h 시점)의 효과적인 최종 시점 스냅샷을 제공하지만, 장기적인 성장 역학이나 공간적 행동은 포착하지 못합니다. 장기간에 걸쳐 연속적인 실시간 추적이 필요한 연구자의 경우, 특수 미세유체 관류 채널이나 자동화된 살아있는 세포 이미징 챔버가 더 적합한 대안이 될 수 있습니다.
세포의 기하학적 구조는 대사 효율과 근본적으로 연결되어 있으며, 특히 표면적 대비 부피(SA/V) 비율은 영양분 획득 및 세포 내 운송의 핵심 동력으로 작용합니다. 이형성 및 사상균에서 길쭉한 균사 형태(hyphal morphotype)로의 전환은 최적화된 SA/V 비율을 유지하기 위한 구조적 적응 기전으로 작용합니다. 이를 통해 균사 끝단 지향적 대사 과정을 유지하는 동시에 확장된 균사벽을 따라 분산된 영양분 흡수가 가능해집니다34,35,36,37. 하지만 본 연구 결과, 형태 측정학적 스케일링은 서로 다른 배수성 상태 및 교배형 유전자좌(mating-type locus) 구성에 따라 균일한 비례 관계로 나타나지 않음을 보여줍니다.
생성된 형태계측 데이터 세트 ~을 통해 이 추적 프로토콜은 배수성과 상관관계가 있는 명확한 구조적 스케일링 경향을 보여주며, 반수체 계통은 모든 기하학적 지표에서 대응하는 이배체 균주보다 일관되게 더 작은 절대값을 나타냅니다.그림 5). 이배체 배경 내에서, 동형접합의 MAT&#945;/&#945; 구성에서 ~ 대비 향상된 필라멘트 형성 역학(길이 및 부피)이 나타났다 MATa/a 또는 MATa/&#945; 이러한 조건 하의 균주들 in vitro 조건들. 강화된 사상형 성장(filamentation)이 종종 침투 능력의 증가와 관련이 있다는 점을 고려할 때, 다음의 임상 분리주들이 왜 C. albicans 주로 이형 접합 이배체로 분리되며 (MATa/&#945;). 면역 능력이 있는 숙주 내에서는 헤테로접합 상태가 장기적인 공생 군집 형성에 더 광범위한 적응도 이점을 제공할 가능성이 있습니다. 다시 말해, 다음과 같은 구조적 특성이 MATa/&#945; 형태형은 숙주의 면역 감시로부터 생존하는 방향으로 최적화되어 있습니다. 따라서 향후 연구에서는 이러한 표준화된 공동 배양 시스템을 활용하여, 다양한 선택 압력 하에서 서로 다른 교배형 동형접합체의 상대적 적응도를 체계적으로 평가해야 합니다.
이전 연구들은 액포의 형태, 분열-융합 역학 및 구조적 확장이 신장하는 진균 필라멘트의 내부 부피와 팽압을 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 입증했습니다. 예를 들어, 도열병균인 Magnaporthe oryzae에서는 가느다란 영양 균사와 구형의 침입 구조 사이의 뚜렷한 전환이 액포 조직의 변화와 밀접하게 조정됩니다38,39,40. 하지만 현재의 프로토콜은 C. albicans의 필라멘트 형성 과정 중 액포 역학을 직접적으로 모니터링하지 않았으며, 이러한 내부 세포소기관의 변화를 전체 구조적 부피와 관련하여 추적하는 것은 향후 연구를 위한 유익한 방향이 될 것입니다. 또한, 특정 진균 유래 분비체 성분이 혈청과 같은 숙주 유래 화학적 유도제와 서로 다른 형태적 스케일링 역학을 유도하는 이유를 밝히기 위한 추가 연구가 필요합니다.
본 프로토콜에 상세히 설명된 비접촉식 공동 배양 방법은 기회감염성 박테리아 군집과 이형성 진균 사이의 신호 전달 역학과 같은 종 간 및 계 간 상호작용을 조사하는 데 응용될 수 있습니다. 또한, 이러한 96-well 및 24-well 포맷은 확장 가능하므로, 이 정량적 플랫폼을 화학적 스크리닝에 활용할 수 있습니다. 그 예로는 기본 세포 생존력에 직접적인 영향을 주지 않으면서 시크리토옴(secretome)에 의해 자극되는 사상형 형성 경로를 선택적으로 차단하는 저분자 억제제 또는 새로운 항진균 화합물의 식별 등이 포함됩니다.

자연 및 임상 생태계에서 미생물은 일반적으로 종 내 및&#160;종 간&#160;통신의 복잡한 네트워크에 의해 제어되는 구조화된 다종 미생물 군집 내에 서식합니다1. 이러한 컨소시엄은 정족수 감지(quorum-sensing) 분자, 휘발성 유기 화합물, 분비 펩타이드 및 단백질을 포함한 다양한 화학적 신호를 사용하여 개체군 수준의 행동을 조절합니다2. 협력적, 경쟁적 또는 포식적 틈새 상호작용이 미생물 대사, 공간 구조 및 스트레스 적응을 크게 변화시키므로 이러한 통신 역학을 매핑하는 것이 매우 중요합니다3. 임상적으로 이러한 다종 미생물 네트워크(예: 이종 세균-진균 또는 종 간 진균-진균 컨소시엄)는 단일 배양에 비해 시너지 효과를 내는 독성, 가속화된 조직 정착 및 증가된 항균제 내성을 빈번하게 나타냅니다4,5. 따라서 미생물 통신의 분자적 결정 요인을 해독하는 것은 전통적인 모델을 넘어 군집 안정성을 파괴하기 위한 혁신적인 항감염 전략을 개발하는 데 필수적입니다6.
미생물 간 상호작용(crosstalk)의 뚜렷한 양상을 분석하기 위해, 연구자들은 주로 포유류 세포 생물학, 면역학 및 종양학에서 사용되는 다양한 실험 구성을 활용한다7,8,9. 예를 들어, 직접 접촉 공동 배양 모델은 &#160;병치 분비(juxtacrine)&#160;신호 전달 및 물리적인 세포 간 결합을 조사하는 표준으로 사용된다10. 이와 유사하게 변형된 설정은 미생물 간의 물리적 상호작용을 연구하여 미생물 간 억제 또는 약물 반응을 이해하는 데에도 사용된다9,11,12. 그러나 접촉 의존적 신호와 확산성 신호가 관찰된 반응에 모두 기여하기 때문에 그 기저 메커니즘을 구분하는 것은 어렵다. 전통적인 접촉 기반 분석법은 공간적 통찰을 제공할 수 있지만, 노동 집약적이거나 서로 다른 균주 라벨링이 필요하며, 이는 비모델 생물체의 경우 번거로울 수 있다. 반대로, Transwell(막 삽입 웰 플레이트) 분석법은 주로 포유류 연구에서 접촉 의존적 신호와 확산성 신호의 기여도를 구분하기 위해 사용된다13,14,15,16. 이 방법은 세포 간 통신이 분비 분자에 의해 매개될 때 특히 유용하며, 세포 집단 간의 신호 전달 역학을 실시간으로 분석할 수 있게 한다17. 나아가, 비접촉 분석법은 막 분리의 장점을 제공하며, 이를 계산 모델과 결합한 실험에 통합함으로써 전통적인 방법으로는 놓칠 수 있는 미생물을 동적으로 추적할 수 있다18. 이러한 접근 방식은 때때로 서로 다른 박테리아 종의 발달 역학을 동시에 연구하는 데 사용된다19.
막 삽입 웰 플레이트 분석법보다 저렴한 고처리량 대안은 무세포 상청액(Cell-Free Supernatant, CFS) 기반 또는 조건 배지 기반 분석법입니다. 이 방법은 재생 의학 및 혈관 생물학 분야에서 줄기세포 매개 조직 수복 및/또는 종양 유도 혈관 신생을 이해하는 데 필요한 시크리토옴을 분리하는 데 사용되는 것으로 알려져 있습니다20. 마찬가지로, 미생물 연구에서 CFS 체계는 다종 미생물 간의 경쟁을 해독하는 데 유용했습니다. 예를 들어, 박테리아 여과액(&#160;Pseudomonas aeruginosa&#160;acyl-homoserine lactones 또는&#160;Lactobacillus&#160;대사산물 등)이 진균 바이오필름의 성숙을 조절하는 데 사용되었습니다21,22.&#160;최근에는 미세유체 플랫폼이 오가노이드-온-어-칩 기술을 통해 고정밀 생체 모사 능력을 가능하게 했습니다23,24. 미세유체 시스템이 시크리토옴에 대한 미생물 군집의 반응을 동시에 검출하는 데 구현되었으나, 이는 전문적인 장비와 숙련도가 필요하며 모든 환경에서 쉽게 구현되지 않을 수 있습니다25,26,27. 따라서 막 삽입 웰 플레이트 및 CFS 기반 분석법이 대부분의 경우 최적의 방법이 될 것입니다. 이 두 분석법 중 선택은 분비 분자의 성격에 따라 달라집니다. 분비 분자가 불안정하여 반감기가 짧고 실시간 활성 측정이 필요한 경우에는 막 삽입 웰 플레이트 분석법이 더 적합합니다. 반면, 분비 분자가 안정적이고 실험 규모가 큰 경우에는 CFS 기반 분석법이 더 경제적일 것입니다.
본 프로토콜의 주요 목적은 멤브레인 인서트 웰 플레이트와 CFS 플랫폼을 사용하여 형태학적 특성을 평가하기 위한 단계별 정성 및 정량 추적 방법론을 제시하는 것입니다(그림 1). 여기서는 Candida albicans와 Candida glabrata 사이의 분비 인자 유도 통신을 예시로 하여 이를 입증하였습니다. 또한, 이러한 도구들은 분비 신호 분자에 노출되었을 때 &#160;C. albicans&#160;균사의 절대적 기하학적 발달(길이, 부피 및 직경)을 변화시키는 내재적 유전 변수(배수성 및 교배형 유전자좌 상태)의 영향을 정량화할 수 있습니다. 확립된 이 프로토콜은 종 간 신호 전달 역학을 연구하는 데 적합하며, 단순하고 경제적인 비접촉식 플랫폼을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;mu;m PES 주사기 필터</td><td>Millipore (Merck)</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>HiMedia</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>HiMedia</td><td>GRM016</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인서트가 포함된 Nunc 24-웰 캐리어 플레이트 (0.4 &amp;mu;m)</td><td>Thermo Scientific</td><td>141002</td><td></td></tr><tr><td>Nunc BioLite 96웰 멀티디쉬, 세포 배양 처리됨, 평평한 바닥</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>프로테오스 펩톤</td><td>HiMedia</td><td>RM005</td><td></td></tr><tr><td>우리딘</td><td>시그마</td><td>U6381</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>HiMedia</td><td>RM027</td><td></td></tr><tr><td>효모 질소 베이스, 황산 암모늄 포함, 아미노산 제외</td><td>HiMedia</td><td>M878</td><td></td></tr></tbody></table>

균류의 종 간 상호작용 중 형태측정학적 연구를 위한 비접촉식 공동 배양 분석법

Contactless Co-Culture Assays for Morphometric Studies During Inter-Species Interactions in Fungi

미생물 군집 내에서 세포의 행동과 형태는 일반적으로 다양한 세포 내외부 요인의 영향을 받습니다. 미생물 간의 소통을 연구하기 위해 사용 가능한 다양한 접근 방식들은 매우 지루하거나 전문적인 시설 및 전문 지식을 필요로 할 수 있습니다.&#160;본 논문에서는 주어진 종간 상호작용에서 다양한 요인의 역할을 조사하기 위해 측정 가능한 반응으로서의 형태적 전이에 기반한 두 가지 상호 보완적인 비접촉식 공동 배양 접근 방식인 멤브레인 인서트 웰 플레이트 공동 배양 분석법과 무세포 상층액(Cell-Free Supernatant, CFS) 기반 분석법을 설명합니다. 멤브레인 인서트 웰 플레이트 시스템은 세포 외 분자의 확산을 허용하면서, 물리적으로 분리된 종 사이의 실시간 상호작용을 가능하게 합니다. 이와 대조적으로, CFS 기반 분석법은 조건화 배지에 대한 반응을 평가하기 위한 단순하고 확장 가능한 접근 방식을 제공합니다. 여기에 제시된 프로토콜에는 배양 준비, 조건화 상층액 생성, 분석 설정, 현미경 관찰, 이미지 획득, Fiji를 이용한 정량적 형태 분석 및 통계적 평가를 위한 표준화된 절차가 포함되어 있습니다. 이는 내인성 및 외인성 요인에 대한 진균의 형태적 반응 사례를 통해 입증되었습니다. 여기서 제시된 방법들은 군집 내의 새로운 미생물 상호작용을 연구하기 위한 접근 가능하고 적응력 있는 대안적 도구를 제공하며, 군집 내 다종 공존의 기저 메커니즘을 조사하는 데 쉽게 확장 적용될 수 있습니다.

종간 상호작용 탐색을 위한 비접촉식 공동 배양 분석
수용성으로 저농도로 존재하는 세포외 신호 전달 분자들은 혼합 미생물 공생 과정에서 핵심적인 통신 이벤트를 매개하는 경우가 많습니다. 이러한 역동성을 평가하기 위해 C. albicans와 C. glabrata 사이의 상호작용 패턴을 분석하면서 직접적인 세포 간 물리적 접촉은 방지하도록 설계된 두 가지 비접촉 세포 기반 실험 체계를 사용하였습니다. 첫 번째 구성은 통합 멤브레인 인서트 웰 플레이트 배양 시스템을 이용한 것으로, 두 균주 집단이 불활성 0.4 µm 다공성 폴리카보네이트 멤브레인에 의해 물리적으로 분리되어 장벽을 통해 분비된 분자들이 방해 없이 양방향으로 확산될 수 있도록 하였습니다. 두 번째 체계에서는 정지기에 도달한 C. glabrata 배양액에서 수집한 세포 제거 상층액(CgCFS)이 포함된 마이크로타이터 플레이트에서 직접 배양된 C. albicans 효모 세포의 성장을 모니터링하였습니다.
이전 스크리닝 결과와 일치하게30, 야생형 이형 접합 이배체 C. albicans 세포(SC5314)는 다음 중 어느 하나에 반응하여 진성 균사(true hyphae)를 쉽게 형성했다. C. glabrata 막 삽입 장벽(membrane insert barrier)에 의해 분리된 세포 또는 여과된 CgCFS. 반면, 순수 음성 대조군 배지(GMM 또는 YPD)에서 배양된 세포는 주로 출아 효모 및 가성균사 형태로 유지되었다(그림 2A). 비교 분석 결과, 두 가지 분석 설정 간의 일관성이 입증되었습니다. 두 분석 모두 필라멘트 길이, 부피, 두께를 포함한 모든 구조적 지표에서 유사한 값을 나타냈습니다.그림 2). 형태학적 파라미터의 차이는 다음의 경우에 유의미한 것으로 간주하였습니다. p적절한 통계 검정의 p-값이 0.05 기준을 충족하였으며, 이어 다중 비교를 위한 사후 검정을 수행하였다. 이러한 관찰 결과는 다음을 보여주었다. C. albicans 세포들은 ~에 의해 유도된 진성 균사의 길이에 있어 유의미한 차이를 보이지 않았으며, C. glabrata 막 삽입 웰 플레이트 설정 내의 세포(39.66 &#181;m &#177; 6.81 &#181;m) 또는 여과된 것에 노출되었을 때 CgCFS (Chronic Fatigue Syndrome, 만성피로증후군)37.13 &#181;m &#177; 6.50 &#181;m; 그림 2B). 마찬가지로, 막 삽입 웰 플레이트 시스템(
) 내에서 유도된 이 필라멘트들의 부피는112.10 &#181;m3&#177; 22.59 &#181;m3) 또한 ~의 결과와 유의미한 차이가 없었다. CgCFS 조건화 배지 (109.78 &#181;m3&#177; 34.69 &#181;m3; 그림 2C). 또한, 필라멘트 직경을 측정한 결과, 두 설정 간의 평균 균사 두께가 1.89의 값으로 일정하게 유지되었음을 확인하였다. &#177; 0.10 &#181;m 멤브레인 인서트 웰 플레이트 구성 및 1.92 &#181;m &#177; 0.23 &#181;m ~을 위한 CgCFS 처리 (그림 2D).
배수성 상태와 교배형 구성은 in vitro 형태학적 크기를 변화시킨다
배수성 수준과 교배 유전자좌 구조가 이형성 전이를 유도하는 역할은 다양한 진균 모델 시스템에서 입증되었습니다. 본 연구에서는 분석 추적 파이프라인을 적용하여 일련의 반수체 (MATa 또는 MATα) 및 이배체 (MATa/a, MATα/α, 또는 MATa/α) C. albicans 균주 전반에 걸쳐 균사 길이, 구조적 부피, 두께 및 그에 대응하는 모효모 세포 부피와 같은 균사 형성 지표를 정량화하였습니다.
구조적 프로파일링 결과, 유도제인 CgCFS 시크리토옴(secretome) 또는 양성 혈청 대조군에 노출되었을 때, 동형 접합 이배체 알파 균주(MATα/α)는 동형 접합 이배체 MATa/a 균주와 비교하여 현저하게 더 긴 축(45.56 µm ± 9.24 µm 및 46.62 µm ± 9.07 µm)과 더 큰 부피(125.24 µm3 ± 39.94 µm3 및 119.45 µm3 ± 37.32 µm3)를 가진 균사를 형성하였습니다(Figure 3A,C). 표준 임상 분리주 C. albicans는 주로 이형 접합 이배체로 존재하지만, 참조 MATa/α 균주는 유도 후(특히 혈청에 의해) MATa/a 균주에 비해 더 긴 균사와 더 큰 부피를 나타냈습니다. 하지만 이들은 동형 접합 MATα/α 균주보다는 현저히 작았습니다(Figure 3B,D).
동시에, 반수체 균주들은 반대되는 양상을 보였는데, 두 유도 조건 모두에서 반수체 MATa 균주가 반수체 MATα 균주에 비해 균사 길이가 유의미하게 증가했습니다 (CgCFS: 22.06 µm ± 5.41 µm 대 17.58 µm ± 4.12 µm; Serum: 23.71 µm ± 6.59 µm 대 21.00 µm ± 5.29 µm; 그림 4A). 흥미롭게도, 반수체 배경에서의 이러한 길이 증가는 CgCFS에 반응했을 때만 균사 부피의 증가(38.84 µm3 ± 19.58 µm3 대 34.25 µm3 ± 19.62 µm3)로 이어졌습니다 (그림 4B). 이러한 초기 in vitro 측정 결과는 배수성 상태와 교배형 유전자좌 구성 사이의 복잡한 상호작용을 시사하며, MATa 및 MATα 유전자좌가 균사 형성 역학에 서로 다르게 기여할 가능성을 보여줍니다.
통합 데이터 세트 전반에 걸쳐 이러한 구조적 지표들 사이의 통계적 관계를 연구하기 위해, 테스트된 모든 배수성 및 접합형 변이체를 포함하는 Spearman 순위 상관 분석(ρ) 및 Pearson 선형 회귀 분석(R2)을 수행하였다. 분석된 모든 쌍에서 양의 상관관계가 관찰되었다: 균사 길이 대 균사 부피, 균사 길이 대 균사 두께, 균사 길이 대 모세포 부피, 그리고 총 균사 부피 대 모효모 세포 부피(그림 5, 보충 표 1 및 보충 표 2).
균사 길이와 계산된 균사 부피 사이에 가장 강한 상관관계가 관찰되었습니다 (ρ = 0.91; 그림 5A). 반대로, 모세포 효모 세포의 초기 부피와 돌출된 균사 부피 사이의 상관관계가 가장 약했습니다 (ρ = 0.63; 그림 5C). 또한, 균사 두께는 균사 부피만큼 균사 길이와 강한 상관관계를 보이지 않았습니다 (그림 5A,D). 모세포 부피, 균사 길이 및 균사 두께의 상관관계에서는 통계적으로 유의미한 차이가 나타나지 않았습니다 (그림 5B,D). 이러한 기하학적 분포는 초기 모세포 효모 세포의 부피가 더 크다고 해서 반드시 더 긴 균사나 더 높은 부피로 이어지는 것은 아님을 시사합니다.
요약하자면, 이러한 결과는 물리적 접촉 없이 C. albicans의 형태 생성 변이를 시각화하고 정량화하는 데 있어 막 삽입 웰 플레이트와 CFS 기반 분석법 모두가 유용함을 입증합니다. 이 프로토콜을 통해 생성된 데이터는 서로 다른 배수성 배경과 교배형 구성에 따른 다양한 형태적 특성을 보여줍니다. 이러한 비접촉 분석 설정은 다양한 미생물 조합 간의 종간 신호 전달 역학을 조사하는 데 적용할 수 있는 유연하고 확장 가능한 방법론을 제공합니다.
<img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig1.jpg" /> 
그림 1: Candida 종을 이용한 멤브레인 인서트 웰 플레이트 공배양 및 CFS 기반 균사 유도 분석의 모식도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig2.jpg" /> 
그림 2: 멤브레인 인서트 웰 플레이트와 CFS 기반 비접촉 분석법 간에 관찰된 균사 형태의 비교. (A) YPD(대조군), 멤브레인 인서트 웰 플레이트 설정 내의 C. glabrata, 또는 C. glabrata 무세포 상층액(CFS)으로 조건화된 배지에 대한 C. albicans의 형태적 반응을 보여주는 대표적인 명시야 현미경 사진. 분홍색, 검은색, 흰색 화살표는 각각 효모, 가성균사 및 진성균사를 나타냄. 스케일 바, 10 µm. 멤브레인 인서트 웰 플레이트 설정 내의 C. glabrata 세포 또는 C. glabrata CFS에 반응하여 관찰된 이형접합 이배체 C. albicans 균주(SC5314)의 균사 길이(B), 균사 부피(C) 및 균사 두께(D). 데이터는 n = 50개 세포, 3회의 독립적인 생물학적 실험으로부터 얻은 중앙값 ± 95% 신뢰 구간을 나타냄. ns, 유의하지 않음: p &#62; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig3.jpg" /> 
그림 3교배형과 접합성이 이배체에서 균사 형태에 유의미한 영향을 미친다. C. albicans. 지정된 유도 분자에 반응하여 동형접합 이배체(A) 및 이형 접합 및 동형 접합 이배체 사이의 (B) 의 *C. albicans*마찬가지로, 언급된 유도 분자에 반응하여 측정된 동형접합 이배체 간의 비교 균사 부피가 (C) 및 이형접합-동형접합 이배체 간의 (D). 대조군: 비균사 유도 배지 대조군인 YPD. 데이터는 중앙값을 나타냄 &#177; n = 50개의 세포를 사용한 3회의 독립적인 생물학적 실험으로부터 얻은 95% 신뢰 구간. 그래프 상단에 표시된 숫자는 pWilcoxon 순위 합 검정 비교를 통해 결정된 p-값. **: p &#60; 0.01, ***: p &#60; 0.001, ****: p &#60; 0.0001, 통계적으로 유의함; ns, 유의하지 않음: p &#62; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig4.jpg" /> 
그림 4: 다양한 분자 유도제에 반응한 반수체 C. albicans의 균사 특성. 그래프는 표시된 유도제에 반응한 반수체 C. albicans 균주의 균사 길이(A)와 균사 부피(B)를 나타냅니다. 대조군: YPD, 비균사 유도 배지 대조군. 데이터는 3회의 독립적인 생물학적 실험에서 n = 50 세포를 대상으로 측정한 중앙값 ± 95% 신뢰 구간을 나타냅니다. 표시된 숫자는 Wilcoxon 순위 합 검정으로 결정된 p-값입니다. **: p &#60; 0.01, ***: p &#60; 0.001, ****: p &#60; 0.0001은 통계적으로 유의미함을, ns는 유의미하지 않음(p &#62; 0.05)을 의미합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig4large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.</a>
<img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig5.jpg" /> 
그림 5: C. albicans의 배수성에 따른 형태학적 파라미터 간의 상관관계. 그래프는 본 연구에서 사용된 형태학적 파라미터들, 즉 균사 부피와 균사 길이(A), 세포 부피와 균사 길이(B), 세포 부피와 균사 부피(C), 그리고 균사 두께와 균사 길이(D) 사이의 Spearman 상관관계 및 선형 회귀를 나타냅니다. ρ: Spearman 상관계수; R2: 선형 회귀 분석의 결정계수; p: p-값. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig5large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>균주</td>
			<td>종</td>
			<td>배수성</td>
			<td>유전자형</td>
			<td>제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 입력해 주세요.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBS138</td>
			<td>Candida glabrata</td>
			<td>단배체 (1n)</td>
			<td>매트 (MAT)&#945;</td>
			<td>ATCC 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5314</td>
			<td>칸디다 알비칸스(Candida albicans)</td>
			<td>이배체 (2n)</td>
			<td>이형접합(MATa/&#945;)</td>
			<td>ATCC MYA-2876</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1132</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>이배체 (2n)</td>
			<td>동형접합(MATa/a); arg4&#916;/arg4&#916;, leu2&#916;/leu2&#916;, his1&#916;/his1&#916;, URA3/ura3&#916;</td>
			<td rowspan="2">Schaefer, D., Côte, P., Whiteway, M., Bennett, R.J. Candida albicans의 배리어 활성은 페로몬 분해를 매개하며 교배를 촉진한다. Eukaryotic Cell. 6 (6), 907–918, doi: 10.1128/ec.00090-07 (2007).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1133</td>
			<td>칸디다 알비칸스(Candida albicans)</td>
			<td>이배체 (2n)</td>
			<td>동형접합(MAT&#945;/&#945;); arg4&#916;/arg4&#916;, leu2&#916;/leu2&#916;, his1&#916;/his1&#916;, URA3/ura3&#916;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY896</td>
			<td>칸디다 알비칸스(Candida albicans)</td>
			<td>단배체 (1n)</td>
			<td>동형접합(MATa); ura3&#8710;::imm434 his4 gal1&#8710;::ura3&#8710;::HIS4</td>
			<td rowspan="2">Hickman, M.A. 외. ‘필수 이배체’인 Candida albicans는 교배 능력이 있는 반수체를 형성한다. Nature. 494 (7435), 55–59, doi: 10.1038/nature11865 (2013).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY803</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>단배체 (1n)</td>
			<td>동형 접합(MAT&#945;); his4 ura3&#916;::HIS4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 본 연구에 사용된 Candida albicans 및 Candida glabrata 균주. 이 표는 비접촉식 멤브레인 인서트 웰 플레이트 공동 배양 및 무세포 상층액(Cell-Free Supernatant, CFS) 기반 분석에서 평가된 진균 균주의 명칭, 구체적인 유전자형, 배수성 상태 및 교배형 접합성을 나타냅니다.
보충 표 1: 다양한 C. albicans 형태학적 파라미터에 대해 수행된 통계 분석 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S1.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 2: 본 연구에서 평가된 다양한 C. albicans 형태학적 파라미터의 모든 생물학적 반복 실험 원시 값.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S2.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 본 연구에 사용된 배지 목록 및 조성.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental File 1.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

종 간 상호작용 중 진균의 형태학적 반응을 정성적 및 정량적으로 평가하기 위한 두 가지 비접촉식 공동 배양 접근법을 설명합니다. 본 프로토콜은 Candida 종 간 분석법을 예로 들어 내인성 요인이 균사 성장에 어떻게 영향을 미치는지 보여줍니다. 이러한 방법들은 다양한 미생물 간의 종 간 통신을 조사하는 데 쉽게 응용될 수 있습니다.

미생물 군집 내에서 세포의 행동과 형태는 일반적으로 다양한 세포 내외적 요인의 영향을 받습니다. 다양한 접근 방식...

본 연구에서는 호스트-병원체 및 진균 간의 종간 상호작용 내 분자 통신을 연구하며, 분비된 신호가 미생물의 형태와 행동을 어떻게 형성하는지 분석합니다. 기존 방법들은 노동 집약적이거나 비용이 많이 들며, 때로는 결과 해석이 모호할 수 있습니다. 본 프로토콜은 새로운 미생물 종간 상호작용을 연구하기 위한 간단하고 적응 가능하며 비접촉 방식의 분석법을 제공합니다. 이 프로토콜은 다양한 생물학적 및 임상적 시스템 전반에 걸친 종간 및 왕국 간(cross-kingdom) 상호작용에 대한 기초 및 중개 연구를 지원합니다.먼저 Candida glabrata CBS 138의 콜로니가 형성된 글루코스 최소 배지(glucose minimal medium) 한천 플레이트, 멸균 루프, 그리고 멸균 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YPD) 액체 배지가 담긴 튜브를 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내부에 배치합니다. 플레이트에서 단일 분리 콜로니를 선택하여 10 mL의 YPD 배지에 접종합니다. 37 °C에서 200 rpm으로 지속적으로 교반하며 18시간 동안 배양합니다. 하룻밤 배양한 배양액을 준비합니다. 광학 현미경을 통해 효모의 형태를 확인하고 오염이 없는지 검증합니다. 배양액을 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 25 °C에서 5,000 x g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고, 세포 펠렛을 막 삽입 분석(membrane insert assay)을 위해 보관합니다. 표적 Candida albicans 균주의 경우, 이배체(diploid) 균주는 5 mL의 GMM 배지에, 단배체(haploid) 균주는 YPD 배지에 단일 콜로니를 접종합니다. 접종된 배양액을 37 °C에서 200 rpm으로 교반하며 12시간 동안 배양합니다. 600 nm에서 하룻밤 배양한 배양액의 광학 밀도(OD)를 측정합니다. 다음으로, 미리 데워둔 GMM을 사용하여 배양액을 최종 부피 1 mL, 600 nm에서의 최종 OD 0.1이 되도록 희석합니다.멸균된 24-well 조직 배양 플레이트를 준비합니다. 선택한 이중 구획 세포 배양 플레이트의 하단 또는 복부 챔버(abdominal chamber)에 600 nm에서 OD 값이 0.1인 Candida albicans 현탁액 1 mL를 각각 넣습니다. 다음으로, Candida glabrata 펠릿을 회수하여 1 mL의 GMM 배지에 재현탁합니다. 5,000 x g에서 3분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 세척 과정을 두 번 반복합니다. 최종 펠릿을 신선한 GMM 배지에 재현탁하고, 세포 현탁액의 600 nm에서의 OD 값을 5로 조정합니다. 그다음, 멸균된 핀셋을 사용하여 0.4 µm 공극의 폴리카보네이트 막이 포함된 멸균 멤브레인 인서트를 각 작업 웰에 배치합니다. 인서트를 웰에 단단히 고정하고, 준비된 Candida glabrata 현탁액 750 µL를 각 상단 또는 루멘 챔버(luminal chamber)에 분주합니다. 조립된 플레이트를 덮고 37 °C에서 3시간 동안 정적으로 배양합니다. 배양 후, 멸균된 핀셋을 사용하여 각 상단 인서트를 제거하고 안전하게 폐기합니다. 형태학적 평가를 위해 DIC 광학과 10x, 20x 및 초장작동거리 40x 대물렌즈가 장착된 도립 현미경 위에 24-well 플레이트를 배치합니다.필요한 배양 기간이 지난 후, 10x 대물렌즈로 웰 바닥을 스캔하여 세포가 균일하게 분포되었는지 확인하고 추적 오류나 비정상적인 응집이 있는지 식별합니다. 핵심 필라멘트 수 및 개체군 분포 데이터 세트를 위해 보정된 20x 대물렌즈를 사용하여 최소 10개의 서로 다른 시야(field of view)를 캡처합니다. 정밀한 표현형 분석 및 세포 경계 측정을 위해서는 40x 초장작업거리(extra-long working distance) 대물렌즈로 마이크로그래프를 캡처합니다. 그런 다음 모든 원본 이미지 파일을 저장합니다. 최신 버전의 Fiji 소프트웨어를 실행합니다. File을 선택한 후 Open을 클릭하여 대상 마이크로그래프를 엽니다. 균사 길이를 측정하려면 Line 선택 아이콘을 클릭하고 Segmented line 도구를 선택합니다. 필라멘트가 모세포(mother yeast cell) 세포벽에서 나오는 접점에 커서를 놓습니다. 곡선과 굴곡을 따라 앵커 포인트를 추가하며 균사의 중앙 종축을 따라 추적하고, 정단 팁(apical tip)에서 종료합니다. Windows에서는 Control + M, Mac OS에서는 command + M을 사용하여 measure 명령을 실행해 Results 창에 총 길이 L을 µm 단위로 기록합니다. Brush 도구를 사용하여 측정된 세포를 표시해 중복 분석을 방지합니다. 해당 세포에 부착된 모세포를 찾습니다. Segmented line 도구로 세포의 최대 장축을 가로지르는 직선을 그려 장축 A를 기록합니다. 그런 다음 장축에 수직이며 가장 넓은 횡단 범위를 가로지르는 선을 그려 단축 B를 기록합니다. 소프트웨어에 포함된 장구형(prolate spheroid) 모델을 사용하여 모세포 부피 CV를 µm³ 단위로 계산합니다. 균사 두께를 측정하려면 Segmented line 도구를 사용하여 균사 길이 축에 수직으로 외벽에서 외벽까지의 선을 그립니다. 필라멘트를 따라 등간격인 세 지점에서 직경을 기록합니다. 세 직경의 산술 평균을 계산하여 평균 두께 d를 구하고, 이를 2로 나누어 반지름 r을 구합니다. 분지되지 않은 필라멘트를 원통으로 간주하여 총 균사 부피 HV를 µm³ 단위로 계산합니다.각 생물학적 반복 실험군에 대해 세포 측정값의 평균 또는 중앙값을 계산하고, 이후의 통계적 비교 분석에는 이러한 반복 실험군 수준의 값을 사용하십시오. 모수적 방법을 적용하기 전에, Shapiro-Wilk 또는 D'Agostino-Pearson 검정을 사용하여 생물학적 반복 실험 데이터 세트의 정규성을 평가하십시오. 두 그룹을 비교할 때 데이터 세트가 정규 분포를 따르면 비쌍체 양측 Student's t-test를 사용하십시오. 통계 분석을 수행하고 그래프 표현을 준비한 후, 모든 그림에 일관된 통계 표기법을 적용하십시오.Candida albicans 세포는 막으로 분리된 Candida glabrata 세포 또는 여과된 Candida glabrata 무세포 상층액(CFS)에 노출되었을 때, 두 가지 비접촉 분석 시스템 모두에서 진성 균사를 형성했습니다. 반면, 대조군 세포는 주로 효모 및 가성균사 형태를 유지했습니다. 막 분리 공동 배양과 여과된 CFS 분석 사이에 유의미한 차이는 관찰되지 않았으며, 두 방법 모두 유사한 균사 길이, 균사 부피 및 두께를 나타냈습니다.본 프로토콜은 미생물 군집 내 종 간 신호 전달에 따른 형태적 반응을 측정함으로써 연구자가 다종 공존 현상을 조사할 수 있게 합니다. 여기서 핵심 과제는 막을 통한 분자 교환을 보장하는 것이며, 이는 플레이트 교반 및 충분한 정수압 유지를 통해 해결할 수 있습니다. 소기관 역학의 살아있는 세포 이미징을 통해 분자 통신이 종 간 상호작용을 기전적으로 어떻게 형성하는지 밝혀낼 수 있습니다.

contactless-co-culture-assays-for-morphometric-studies-during-inter

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 상피 세포와 세균의 동시와 언어 문화 microfluidic 공동 문화 모델을 설명합니다. 이 모델은 putative probiotic 박테리아 변종의 효과를 pathogenesis에 다른 수용성 분자 신호의 역할을 조사뿐만 아니라 화면을 사용할 수 있습니다.

Microfluidic 가용성식이 중재 신호의 상호 작용을 조사하는 상피 세포 박테리아의 공동 문화

우리는 이온 채널의 기능에 대한 단일 지점에서 돌연변이의 효과를 연구하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

이 문서는 stepwise 방식으로 표현하고자하는 일반적으로...

사용 Schwann - astrocyte 상호 작용 분석 체외에서 Assays

이 동영상은 호기성 곰팡이로 리그노셀룰로오스성 식물 조직의 저하를 연구하기위한 통제된 환경의 접근 방식을 보여줍니다. 영양 소스 및 습기를 제어하는​​ 능력은 한천 블록 microcosms의 주요 장점이지만, 그 접근 방식은 종종 혼합 성공을 산출. 우리는 재현성, 낮은 다양성의 결과를 얻을 수에 중요한 함정을 해결합니다.

에어로빅 곰팡이에 의해 제어 플랜트 조직 분해에 대한 한천 - 블럭 Microcosms

여기에서 우리는 사멸 세포 간극의 역학을 공부하는 효과적인 방법을...

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

치료 화합물은 종종 첫 번째 생존 분석과 시험 관내에서 검사합니다. 인간의 관찰자에 의해 블라인드 세포 수는 세포 수의 작은 변화에 매우 민감 할 수 있지만 기능을 평가하지 않습니다. 컴퓨터 생존 분석, 여기에 설명 된대로 객관적인 구조와 기능을 모두 평가할 수 있습니다.

문화의 세포에 대한 생존 분석 실험

이 원고 형태학 및 설치류의 악의 관절 돌기 내의 세포질 변화를 분석 하기 위한 메서드를 제공 합니다.

형태학 및 Murine 악의 관절 돌기 세포 분석 방법

엔토모병원성 진균 콜로니는 테네브리오 미끼, 갤러리아 미끼 및 선택적 인공 배지, 즉 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드(CTC 배지)로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천을 사용하여 열대 토양 샘플로부터 분리된다.

토양 샘플에서 엔토모병원성 곰팡이를 분리하는 방법의 비교

여기에 제출된 프로토콜은 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 RNA 시퀀싱 전사체 데이터에서 circRNA를 예측하고 기능적으로 특성화하는 데 필요한 완전한 인실리코 파이프라인을 설명합니다.

인 실리코 숙주-병원체 상호작용 중 circRNA의 식별 및 특성화

막 접촉 부위(MCS)를 연구하기 위한 새로운 접근법의 필요성은 이러한 세포 구조와 그 구성 요소 연구에 대한 관심이 증가함에 따라 증가했습니다. 여기에서는 MCS에 상주하는 세포 소기관 내 및 세포 기관 간 단백질 복합체를 식별하고 정량화하기 위해 이전에 사용 가능한 현미경 기술을 통합하는 프로토콜을 제시합니다.

근접 결찰 분석에 의한 ER-미토콘드리아 접촉 부위에서 내인성 세포 기관 내 단백질 상호 작용의 시각화 및 정량화

배우세요 균류의 종 간 상호작용을 연구하는 비접촉식 공동 배양 분석법을 활용한 형태측정학적 연구 방법을. 막 삽입 웰 플레이트 및 세포 무상청액 기반 분석법으로 미생물 형태 변화를 정량적으로 측정할 수 있습니다.

균류의 종 간 상호작용 중 형태측정학적 연구를 위한 비접촉식 공동 배양 분석법

더 많은 동영상 탐색