LncRNA와 직접 상호작용하는 단백질을 검증 가능한 확인을 위한 자외선 기반 ChIRP 방법 - 배양된 세포부터 마우스 고환까지"

본 연구에서는 배양 세포와 고환과 같은 천연 조직 모두에서 RNA와 단백질의 상호작용을 직접 매핑하고 정자 형성 과정에서 TUG1의 분자 기전을 규명하기 위한 UV 가교 방법인 cPDiRT를 개발하였습니다. 이 프로토콜을 통해 배양 세포부터 온전한 천연 조직에 이르기까지 더 넓은 범위의 시스템에서 RNA-단백질 상호작용을 직접 매핑할 수 있습니다. 우선, 잔류 배양액을 제거하기 위해 GC2 세포를 PBS로 3회 세척하십시오.

그 다음, 접시에 3 mL의 PBS를 넣고 가교 결합 전 균일하게 분배합니다. 254 nm 자외선 가교 결합기를 사용하여 4,000 mJ/cm²의 선량으로 세포를 조사합니다. PBS로 세포를 수집하고, 세포 현탁액을 4 °C에서 3000G로 5분간 원심 분리합니다.

상층액을 버린 후, 펠렛의 무게를 측정하여 샘플당 최소 500 milligrams의 펠렛 질량이 확보되었는지 확인합니다. 4주령의 수컷 C57BL6 마우스로부터 고환을 수집합니다. 피막을 제거한 고환 조직을 5 to 10 milliliters의 DMEM으로 2회 세척합니다.

그런 다음, 1 mg/mL collagenase IV가 포함된 DMEM 10 mL와 함께 조직 100 mg을 37 °C에서 배양합니다. 세정관이 분리될 때까지 5~15분 동안 소화를 계속합니다. 그 후, 현탁액을 4 °C에서 1000G로 1분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.

펠렛을 5~10 mL의 DMEM으로 세척합니다. 현탁액을 4 °C에서 1000G로 1분 동안 다시 원심 분리합니다. 그리고 1 mg/mL deoxyribonuclease I가 포함된 0.25% trypsin에 펠렛을 다시 현탁합니다. 현탁액을 37 °C에서 5~15분 동안 배양합니다.

그 다음, 효소 소화를 중단시키기 위해 10% FBS가 첨가된 DMEM을 동일한 부피로 추가합니다. 현탁액을 70-micrometer 셀 스트레이너로 여과합니다. 세포를 4°C에서 2000G로 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 버리고 펠릿을 5 to 10 milliliters의 PBS로 세척합니다. 현탁액을 4 °C에서 2000G로 5분 동안 다시 원심분리합니다. 단일 세포 현탁액을 PBS에 재현탁하고 15-centimeter 배양 접시에 균등하게 분배합니다.

GC2 세포에 대해 앞서 설명한 것과 동일한 방식으로 고환 세포를 가교 결합합니다. 대조군 세포의 경우 조사 과정은 생략합니다. 가교 결합된 세포를 수집합니다.

현탁액을 4°C에서 3000G로 5분 동안 원심 분리한 후 상층액을 제거하십시오. 최소 10~12마리의 마우스에서 분리한 고환 세포를 모아 펠릿의 질량이 최소 500mg이 되도록 하십시오. 펠릿의 무게를 측정한 후, 펠릿 100mg당 버퍼 1mL의 비율로 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)에 재현탁하십시오.

볼텍싱 후, 용해물이 시각적으로 투명해질 때까지 집중 초음파 분쇄기 또는 워터배스 초음파 분쇄기를 사용하여 시료를 초음파 처리합니다. 그다음, RNA 및 단백질 분석을 위해 용해물 약 10 µL를 마이크로원심분리 튜브에 분주합니다. 용해물에 미리 세척한 자기 비드 30 µL를 첨가합니다.

하이브리다이제이션 오븐에서 샘플을 37 °C로 30분 동안 부드럽게 혼합하며 배양합니다. 샘플을 마그네틱 스탠드에 올려놓고 약 1분 동안 또는 용액이 투명해질 때까지 둡니다. 투명해진 용해물을 새 튜브로 옮깁니다.

새 튜브를 마그네틱 스탠드 위에 놓습니다. 그런 다음, 잔류 비드를 제거하기 위해 용해물을 다른 튜브로 옮깁니다. 각 시료에 37 °C로 온도를 맞춘 하이브리다이제이션 버퍼를 2배 부피만큼 첨가합니다.

용해물 1 mL당 100 µM 프로브 스톡 1 µL의 비율로 비오틴화 DNA 프로브를 추가합니다. 하이브리다이제이션 오븐에서 샘플을 37 °C로 유지하며 12~16시간 동안 end-over-end 회전 방식으로 배양합니다. 사용 직전에 스트렙타비딘 자성 비드 100 µL를 세포 용해 버퍼로 3회 세척합니다.

마지막 세척 후 잔류 버퍼를 제거합니다. 하이브리다이제이션 반응 튜브를 짧게 원심 분리합니다. 그다음, 하이브리다이제이션된 샘플을 세척된 비드에 추가하고 부드럽게 혼합합니다.

비드 현탁액을 원래의 튜브에 넣고 혼합하면서 37 °C에서 30~40분 동안 배양합니다. 배양 후, 샘플을 짧게 원심 분리합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 1~2분 동안 또는 용액이 투명해질 때까지 둡니다.

그런 다음 상층액을 제거합니다. 비드를 세척하려면 세척 버퍼 1 mL를 넣고 37 °C의 하이브리드화 오븐에서 5분 동안 튜브를 배양합니다. 5회 세척 후, RNA 분석을 위해 비드의 1-10%를 새 튜브로 옮깁니다.

마지막으로, 남은 비드에 1X SDS 샘플 버퍼 40 µL를 추가합니다. 단백질을 용출시키고 가교 결합을 해제하기 위해 샘플을 95 °C에서 30분 동안 가열합니다. 이후 하류 질량 분석 분석을 위해 단백질을 회수합니다.

ChIRP 질량 분석을 통해 GC2 세포에서 음성 대조군에 비해 농축된 190개 이상의 단백질을 식별했습니다. 4,000 millijoules per square centimeter의 UV 조사량에서 cPDiRT-MS는 더 선택적인 단백질 세트를 식별했습니다. 이러한 단백질의 3분의 2 이상이 기존 ChIRP-MS에 의해 식별된 단백질과 일치했습니다.

최소 두 개의 고유 펩타이드로 확인된 대부분의 단백질은 GC2 세포와 생쥐 고환의 생물학적 반복 실험 모두에서 재현성 있게 검출되었습니다. 재현성 있게 확인된 단백질의 유전자 온톨로지 분석 결과, TUG1의 알려진 기능과 광범위하게 일치하는 생물학적 과정이 나타났습니다. GC2 세포와 생쥐 고환 데이터 세트를 비교한 결과, 공통적으로 농축된 15개의 단백질이 확인되었습니다.

강화된 교차결합 면역침전 시퀀싱(cross-linking immunoprecipitation sequencing)을 통해 TUG1 전사체에서 PABPC1 및 CCT3의 명확하고 특이적인 결합 피크가 확인되었습니다. cPDiRT를 이용하면 연구자는 배양 세포와 천연 조직 모두에서 특정 연결된 RNA와 직접 상호작용하는 단백질을 식별하고 측정할 수 있습니다. 가장 중요한 과제는 직접적인 RNA 및 단백질 상호작용에 대한 높은 특이성을 보장하면서 효율적인 UV 교차결합을 달성하는 것입니다.

본 프로토콜은 이러한 접근 방식을 다른 RNA 및 조직에 적용하여 발달 및 생식 과정에서 직접적인 RNA 단백질 상호작용을 규명하는 향후 연구를 지원할 것입니다.