Name: AAVS1에서 독시사이클린 유도성 ASCL1/DLX2 발현을 이용한 인간 유도 다능성 줄기세포로부터 GABA 신경세포 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-31T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9를 이용해 AAVS1 안전항자리에 ASCL1과 DLX2를 도입하고 독시사이클린으로 유도하여 인간 유도 다능성 줄기세포에서 GABA 신경세포를 효율적으로 분화시키는 방법을. 이 프로토콜은 신경질환 연구에 유용합니다.

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	<li>Mertens J, Marchetto MC, Bardy C, Gage FH. Evaluating cell reprogramming, differentiation, and conversion technologies in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 2016 Jul;17(7):424-37.</li>
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<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector&trade; Core Unit</td><td>로자</td><td>AAF-1002B</td><td>hiPSCs의 전기 투과/핵 주입을 위한 장치.</td></tr><tr><td>6웰 배양 플레이트</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920300</td><td>hiPSC 유지 및 분화를 위한 조직 배양 처리된 플레이트.</td></tr><tr><td>BDNF(뇌 유래 신경영양인자)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78005</td><td>신경 성숙을 위한 재조합 인간 단백질; 제조업체 지침에 따라 준비하고 최종 농도 10 ng/mL로 사용.</td></tr><tr><td>세포 카운터(Countess)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10283</td><td>세포 계수에 사용.</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>VWR</td><td>76468-134</td><td>세포 펠레팅용.</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heracell VIOS 160i 또는 동등</td><td>37 &deg;C, 가습된 대기, 5% CO2를 유지하는 세포 배양 인큐베이터.</td></tr><tr><td>크라이오튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td>hiPSC 동결을 위한 멸균 극저온 바이알; 외부 나사 1.8-2.0 mL 크라이오바이알을 외부적으로 사용할 수 있음.</td></tr><tr><td>Cultrex UltiMatrix 감소된 성장 인자 기저막 추출물</td><td>Bio-Techne</td><td>BME001-05</td><td>프로토콜에서 사용되는 표준 BME 코팅 매트릭스. Bio-Techne 분석 인증서에서 로트별 재고 농도를 확인하고 DMEM/F-12에 80 &micro;g/mL 작업 농도로 희석.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Wisent</td><td>319-090-CL</td><td>BME를 희석하는 데 사용되는 기본 매체.</td></tr><tr><td>DMSO(디메틸 설폭사이드)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>동결 매체 제조에 사용되는 동결 보호제.</td></tr><tr><td>기증자 플라스미드: 유도 가능한 ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 타겟팅 카세트</td><td>맞춤형 플라스미드</td><td>Addgene 등록 대기중</td><td>도시사이클론 유도 ASCL1-P2A-DLX2 카세트 및 선택/보고 요소를 포함하는 맞춤형 AAVS1 기증자 플라스미드. 플라스미드 맵 및 전체 서열을 보조 파일 또는 요청 시 제공.</td></tr><tr><td>독시사이클린 하이클레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>ASCL1-P2A-DLX2 발현을 유도하는 데 사용. 멸균 스톡 용액을 준비하고, 분리하고, 빛으로부터 보호하고, 동결 상태로 저장하고, 최종 농도 1 &micro;g/mL로 사용.</td></tr><tr><td>에탄올(70%)</td><td>상업용 알코올 / 그린필드 글로벌</td><td>P016EAAN</td><td>생물학적 안전 캐비닛 내부 살균; 기관 승인된 70% 에탄올 또는 동등한 것을 사용.</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>ECHO</td><td>Revolve R4</td><td>보고자 발현 및 신경 형태학의 위상차 및 형광 이미지를 촬영하는 데 사용되는 현미경.</td></tr><tr><td>GDNF(신경교 유래 신경영양인자)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78058</td><td>신경 성숙을 위한 재조합 인간 단백질; 제조업체 지침에 따라 준비하고 최종 농도 10 ng/mL로 사용.</td></tr><tr><td>hiPSC 라인 PGP1</td><td>EditCo Bio</td><td>PGP1 인간 iPSC 라인</td><td>이 프로토콜에 사용된 상업적으로 이용 가능한 공개 동의 인간 iPSC 라인; 수정 및 분화 전에 패시지 번호 및 QC 상태를 기록.</td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>ImageJ/Fiji</td><td>오픈 소스; 사용된 버전 보고해야 함</td><td>형광 정량화 및 대표 이미지 처리를 위한 소프트웨어.</td></tr><tr><td>KnockOut&trade; 혈청 대체물(KOSR)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>동결 매체 준비에 사용.</td></tr><tr><td>라미닌-521</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0117</td><td>표준 코팅 프로토콜의 일부는 아님. 신경 분리가 지속될 경우 대체 또는 이중 코팅 매트릭스로 사용할 수 있는 문제 해결용 선택적 시약.</td></tr><tr><td>액체 질소 듀워</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Locator 6 Plus 또는 동등</td><td>기관 극저온 안전 절차에 따라 증기상 또는 액체 질소에서 동결된 hiPSCs의 장기 저장.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty&trade; 동결 컨테이너</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>-80 &deg;C에서 세포의 제어 속도 동결을 위한 컨테이너.</td></tr><tr><td>mTeSR&trade; Plus</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td>hiPSCs의 피더 없는 유지 매

aavs1에서 독시사이클린 유도성 ascl1/dlx2 발현을 이용한 인간 유도 다능성 줄기세포로부터 gaba 신경세포 생성

Generation of GABAergic Neurons from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Doxycycline-Inducible ASCL1/DLX2 Expression at AAVS1

AAVS1에서 독시사이클린 유도성 ASCL1/DLX2 발현을 이용한 인간 유도 다능성 줄기세포로부터 GABA 신경세포 생성

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) offer an unprecedented opportunity to model human neurological diseases in vitro. Reliable generation of ...

본 연구는 인간 신경 다양성과 질환을 모델링하기 위해 hiPSC로부터 순수한 GABA성 뉴런 집단을 생성하는 데 중점을 둡니다. 기존 프로토콜은 분화 시마다 반복적인 바이러스 형질전환이 필요했습니다. 본 프로토콜은 AAVS1 세포주를 사용하여 이러한 한계점을 해결합니다.먼저, 50 mL 코니컬 튜브에 40 mL의 knock-out serum replacement(KOSR)와 10 mL의 DMSO를 혼합하여 동결 배지를 준비합니다. 피펫팅을 10회 반복하여 동결 배지를 균질화한 후, 용액을 4 °C에서 보관합니다. 다음으로, basement membrane extract(BME)를 DMEM 및 F12 배지로 희석하여 최종 농도를 80 µg/mL로 맞춥니다. 6-well 플레이트의 각 웰에 희석된 BME 1 mL를 넣습니다. 플레이트를 기울여 용액이 웰의 전체 표면에 고르게 퍼지도록 하여 코팅되지 않은 영역이 없게 한 뒤, 플레이트를 37 °C에서 최소 30분 동안 배양합니다.흡입 피펫을 사용하여 인간 유도만능줄기세포(hiPSCs)가 포함된 웰에서 배지를 흡입하여 제거합니다. 웰에 ReLeSR 1 milliliter를 첨가하고 상온에서 30초 동안 배양합니다. 해리 시약을 흡입하여 제거하고 플레이트를 37 degrees Celsius에서 8분 동안 배양합니다. 5-milliliter 피펫을 사용하여 hiPSC 유지 배지 1 milliliter를 웰에 조심스럽게 첨가합니다. 세포 현탁액을 50-milliliter 튜브에 수집합니다. 마이크로원심분리 튜브에서 세포 현탁액 10 microliters와 trypan blue 10 microliters를 혼합합니다. 혼합액 10 microliters를 세포 계수 슬라이드에 로드하고 생존 세포 농도를 측정합니다. 이전에 준비한 웰에서 BME 코팅을 흡입하여 제거한 후, Rho-associated coiled-coil kinase 또는 ROCK 억제제가 첨가된 hiPSC 유지 배지 2 milliliters를 첨가합니다. 생존율 90% 이상을 목표로 hiPSCs 100,000개를 웰에 분주합니다. 세포가 균일하게 분포되도록 플레이트를 8자 모양으로 움직인 후, 5% carbon dioxide 조건의 37 degrees Celsius에서 세포를 배양합니다. 24시간 후, 배지를 ROCK 억제제가 없는 신선한 mTeSR plus 배지 2 milliliters로 교체합니다.세포의 합류

generation-gabaergic-neurons-from-human-induced-pluripotent-stem

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Stemgent 독스의 Inducible 마우스 TF의 Lentivirus 세트 유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 셀에 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 재설 정할 수 있습니다. 다음은 마우스 프로그래밍 전사 요인 Oct4의 독스 - inducible 표현에 대한 프로토콜을 보여줍니다, Sox2, Klf4과 c - Myc은 표현하는 일반적인 MES pluripotency 마커 IPS의 식민지를 생성합니다.

4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

이 비디오는 배아체(EB)를 신경 상피 응집체로 분화하고 이후 신경 세포와 신경교세포로 분열하는 과정을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 in vitro에서 신경 세포 및 신경교세포를 효율적으로 생성할 수 있으며, 이는 독성 테스트를 위한 테스트 시스템 역할을 할 뿐만 아니라 신경 독성과 관련된 다양한 경로를 평가할 수 있습니다.

Generating Neurons and Glial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Embryoid Bodies

이 비디오는 테트라사이클린 반응성 요소의 제어 하에 신경인성 전사 인자 유전자를 운반하는 엔지니어링된 렌티바이러스로 인간 만능 줄기세포를 형질 주입하여 뉴런으로 분화하도록 유도한 후 테트라사이클린 유도체 및 성숙 배지로 처리하는 과정을 보여줍니다.

조작된 렌티바이러스를 사용한 뉴런의 인간 만능 줄기세포 분화

이 절차는 인간의 개발 기간 동안 관찰 것과 유사한 대를 이동하여 telencephalic 뉴런을 산출. 세포는 자발적으로 차별화 할 수있는 신경 계통 기수를 밀어 요인에 노출되어 격리되며, 터미널 차별화과 성숙을 할 수 있도록 coverslips에 도금되어 있습니다.

인간 만능의 줄기 세포에서 Telencephalic Glutamatergic 뉴런의 사양

이 절차는 자궁 내 전기천공법을 통해 발달 중인 마우스 전뇌의 인터뉴런을 표적으로 삼는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 피질의 표재층으로 향하는 중간뉴런 아형에서 선택적 유전자 발현을 달성하는 데 특히 효율적이었습니다.

두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로

우리는 발달 생물학의 지식과 발표된 연구를 바탕으로 인간 배아 줄기 세포와 인간 유도 만능 줄기 세포 모두에서 A9 중뇌 도파민 뉴런을 효율적으로 생성할 수 있는 최적화된 프로토콜을 개발했으며, 이는 파킨슨병에 대한 질병 모델링 및 세포 대체 요법에 유용할 것입니다.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

신경 상피 조직의 전례 없는 복잡성으로 인해 인간의 뇌 발달을 모델링하는 데 방해를 받았습니다. 여기에서는 인간 뇌 발달의 초기 사건을 묘사하고 체외에서 소두증을 모델링하기 위해 뇌 오가노이드의 강력한 생성 방법을 설명합니다.

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

신경 퇴행의 뉴런-아교 세포 상호 작용은 부적절한 도구와 방법으로 인해 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 인간 만능 줄기 세포에서 유도 뉴런, 희소돌기아교세포 전구세포 및 희소돌기아교세포를 얻기 위한 최적화된 프로토콜을 설명하고 알츠하이머병에서 세포 유형 특이적 기여를 이해하는 데 있어 이러한 방법의 가치에 대한 예를 제공합니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

신경 프로그래밍에 의해 생성 된 인간 다 능성 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런의 이식은 신경 발달 장애에 대한 잠재적 인 치료 접근법이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런 전구체의 생성 및 신생아 마우스의 뇌에 이식하여 이식 된 뉴런의 장기 조사 및 치료 잠재력 평가를 가능하게합니다.

신경 발달 장애를 완화하기 위해 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런을 출생 후 초기 마우스 해마에 이식

배우세요 CRISPR/Cas9를 이용해 AAVS1 안전항자리에 ASCL1과 DLX2를 도입하고 독시사이클린으로 유도하여 인간 유도 다능성 줄기세포에서 GABA 신경세포를 효율적으로 분화시키는 방법을. 이 프로토콜은 신경질환 연구에 유용합니다.

AAVS1에서 독시사이클린 유도성 ASCL1/DLX2 발현을 이용한 인간 유도 다능성 줄기세포로부터 GABA 신경세포 생성

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