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본 연구는 중국 국가자연과학재단(82273554), 산둥성 의료 및 보건 과학 기술 발전 프로젝트(No.202304030716), 중국 국가 대학생 혁신 및 창업 훈련 프로그램(No. 202410439001) 및 타이안 과학 기술 혁신 발전 프로젝트(No. 2023NS232)의 지원을 받았습니다.

본 연구는 산동제일 의과대학교(Shandong First Medical University) 동물윤리위원회의 승인을 받았습니다. &amp;#38; 산동 의과과학원(Shandong Academy of Medical Sciences)(W202112030345). 모든 방법은 관련 가이드라인 및 규정을 준수하여 수행되었습니다.
1. 3BDO@MN 패치의 제작
<ol>
	<li>CS/HA 제형 준비
	<ol>
		<li>CS 분말(탈아세틸화도 ≥ 95%) 1 g을 정밀하게 측정하여 증류수 20 mL에 첨가하고, 상온(RT)에서 10분 동안 교반한다.</li>
		<li>2% (v/v) 아세트산 용액(분자량 60.05) 0.4 mL를 추가하고 2시간 동안 계속해서 교반한다. 
		주의: 농축 아세트산은 부식성 물질이다. 희석 및 취급은 흄 후드 내에서 수행하며, 피부 및 점막과의 접촉을 방지하기 위해 일회용 장갑과 고글을 착용한다.</li>
		<li>HA 분말 2 g을 추가한 다음, 혼합 제형을 1,207 × g (약 3,000 rpm)에서 5분 동안 원심분리하여 완전히 용해시킨다. 
		&#8203;참고: CS/HA 제형은 즉석에서 준비해야 하며, 4 °C 냉장고에 24시간 이내로 보관할 수 있다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3BDO 함유 CS/HA 제형 준비
	<ol>
		<li>미리 용해된 3BDO 용액(2 mg/mL)을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 첨가한다. 
		주의: DMSO는 피부 투과성이 있다. 작동 중에 직접적인 피부 접촉을 피하기 위해 장갑을 착용하고, 이를 CS/HA 제형에 첨가한다. 완전히 용해될 때까지 혼합한다.</li>
		<li>혼합 제형을 1,207 × g에서 5분 동안 원심분리하여 갇힌 기포를 제거한다. 
		&#8203;참고: 원심분리 후에도 기포가 남아 있는 경우, 제형을 5분 동안 방치한 후 다시 원심분리한다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3BDO@MN 패치 제작
	<ol>
		<li>높이 600 µm, 바닥 직경 250 µm, 피치 550 µm의 원뿔형 팁이 20 × 20 배열로 구성된 폴리디메틸실록산(PDMS) MN 몰드를 사용한다.</li>
		<li>플라스마 세정기를 사용하여 PDMS 몰드의 표면을 처리해 완전히 친수성으로 만든다.</li>
		<li>3BDO@CS/HA 제형 1 mL를 PDMS MN 몰드에 첨가한다. 몰드를 진공 챔버에 넣고 10분 동안 진공을 가하여 점성이 있는 제형이 미세 공동(micro-cavity) 내부로 잘 침투하도록 한다.</li>
		<li>제형이 모든 공동을 채울 수 있도록 몰드를 상온(RT)에서 134 × g으로 5분 동안 원심분리한다. 멸균된 금속 스크레이퍼를 사용하여 몰드 표면의 과잉 제형을 조심스럽게 제거하여 완벽하게 평평한 면이 되도록 한다.</li>
		<li>3BDO가 포함되지 않은 CS/HA 매트릭스 혼합물을 몰드 표면에 도포한다. 상온(RT)에서 134 × g으로 5분 동안 원심분리하여 균일한 지지층(backing layer)을 형성한다.</li>
		<li>몰드를 36 °C, 습도 37%의 오븐에 넣고 밤새(약 12~16시간) 건조시킨다.</li>
		<li>몰드가 상온(RT)으로 식은 후, 완전히 건조된 MN 패치를 몰드에서 떼어낸다. 
		참고: 제작된 3BDO@MN 패치는 사용 전까지 4 °C 냉장고에 보관한다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 3BDO@MN 패치의 특성 분석
<ol>
	<li>준비된 3BDO@MN 패치를 양면 전도성 탄소 테이프를 사용하여 스텁에 고정합니다.
	<ol>
		<li>전기 전도성을 높이기 위해 고정된 샘플에 금(또는 백금)을 얇게 스퍼터 코팅합니다.</li>
		<li>시편 스텁을 전계 방사형 주사 전자 현미경(FE-SEM)의 진공 챔버에 넣습니다.</li>
		<li>고해상도 이미지를 얻기 위해 가속 전압과 작동 거리를 조정합니다. 전체 어레이의 형태와 개별 MN의 미세 표면 지형을 관찰합니다.</li>
		<li>대표적인 SEM 마이크로그래프를 획득합니다. MN의 길이와 팁 직경을 측정합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>기계적 강도 테스트
	<ol>
		<li>텍스처 분석기의 샘플 테스트 스테이지 위에 MN 패치를 평평하게 놓습니다. 기판이 완전히 평평하고 바늘 팁이 정면 위쪽을 향하고 있는지 확인합니다.</li>
		<li>평평한 원통형 프로브(직경 25 mm)를 기기의 로드셀에 단단히 부착합니다.</li>
		<li>프로브가 MN 팁 바로 위에 위치할 때까지 수직으로 내립니다. 테스트 전에는 프로브와 팁 사이에 물리적 접촉이 없도록 합니다.</li>
		<li>소프트웨어에서 특정 테스트 파라미터를 설정합니다. 하강 테스트 속도는 0.05 mm/s로, 목표 변위 거리는 0.7 mm로 설정합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>용해 테스트
	<ol>
		<li>해부판 위에 쥐의 등 피부를 펼치고 피부 표면의 물기를 닦아냅니다. 피부를 평평하게 유지하고 주름이 없도록 합니다.</li>
		<li>바늘 팁이 아래를 향하도록 건조된 MN 패치를 피부 표면에 놓고, MN이 피부에 삽입되도록 균일한 수직 압력을 가합니다.</li>
		<li>정해진 시간 간격(5, 10, 30, 60 s)으로 피부에서 패치를 제거하고 5분 동안 건조합니다.</li>
		<li>동일한 이미징 조건에서 SEM을 통해 잔여 형태를 관찰합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>In vitro 약물 방출 분석
	<ol>
		<li>6-웰 플레이트의 각 웰에 인산염 완충 식염수(PBS) 500 µL를 넣습니다. 3BDO가 적재된 MN을 각 웰에 넣어 PBS와 접촉하게 합니다.</li>
		<li>플레이트를 상온(RT)에서 배양합니다. 각 시간대마다 3BDO 농도 정량을 위해 PBS 500 µL를 수집합니다.</li>
		<li>싱크 조건(sink conditions)을 유지하기 위해 각 웰에 즉시 신선한 PBS 500 µL를 보충합니다.</li>
		<li>MN에 처음에 적재된 총 약물량을 기준으로 방출된 3BDO의 누적 백분율을 계산합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>항균 분석
	<ol>
		<li>저장소(-80 °C)에서 박테리아 세포 스톡(E. coli 및 Staphylococcus aureus)을 꺼내어, 각 박테리아 세포 스톡 10 µL를 5 mL의 LB 배지에 넣습니다.</li>
		<li>접종된 배지를 인큐베이터 쉐이커에서 37 °C, 250 rpm으로 약 16시간(하룻밤) 동안 배양합니다.</li>
		<li>LB 배지를 사용하여 박테리아 배양액의 초기 OD620을 0.01로 조정합니다.</li>
		<li>CS 스톡 용액을 멸균수로 희석하여 6가지 농도(1, 5, 10, 50, 100, 500 mg/mL)의 CS 용액을 준비하며, 각 농도당 3회 반복합니다.</li>
		<li>샘플을 블랭크군, 대조군, CS군의 세 그룹으로 나눕니다. 블랭크군에는 LB 200 µL를 추가합니다. 대조군에는 박테리아 용액 180 µL와 멸균수 20 µL를 추가합니다. CS군에는 박테리아 용액 180 µL와 해당 농도의 CS 용액 20 µL를 추가합니다.</li>
		<li>37 °C에서 20시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>흡광도 플레이트 리더를 사용하여 0시간과 20시간에서 96-웰 플레이트의 각 웰의 OD620을 측정하고 기록합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>세포 독성 평가
	<ol>
		<li>표피 또는 진피 세포 현탁액 100 µL를 96-웰 플레이트에 분주합니다(웰당 2 × 103 cells).</li>
		<li>지정된 웰에 각각의 처리물을 10 µL씩 추가하여 네 그룹을 설정합니다: 대조군(배양액), 3BDO군(최종 농도 1 µM), MN 추출물군, 3BDO+MN 추출물군이며, 각 그룹당 3회 반복합니다.</li>
		<li>37 °C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>각 웰에 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 작동 용액 10 µL를 추가합니다. 
		참고: 기포는 흡광도 측정값에 영향을 줄 수 있으므로 웰 내에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.</li>
		<li>37 °C, 5% CO₂ 조건에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 모든 웰의 450 nm 흡광도를 측정합니다.</li>
		<li>데이터를 분석하여 세포 생존율을 계산합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 동물 실험
<ol>
	<li>실험 동물 준비 및 처리
	<ol>
		<li>7주령 수컷 C57BL/6 마우스를 isoflurane으로 마취하고, 마취 중에 체온 조절을 실시한다. 
		주의: Isoflurane은 휘발성 마취제이다. 과도한 흡입을 피하기 위해 환기가 잘 되는 환경에서 작업하십시오.</li>
		<li>마우스의 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안구 윤활제를 도포한다.</li>
		<li>전기 면도기를 사용하여 마우스의 등 쪽 털을 약 2 × 2 cm2 면적으로 제모한다.</li>
		<li>제모 크림을 바르고 5–10 s 동안 기다린 후 닦아낸다. 식염수 스왑으로 피부를 닦아 남아 있는 제모 크림과 털을 제거한다.</li>
		<li>MN 패치를 다듬어 준비해 둔다.</li>
		<li>제모한 마우스를 무작위로 5개 그룹(그룹당 n = 5)으로 나누어 다음과 같이 처리한다:
		<ol>
			<li>미처리 대조군: 아무런 처리 없이 털만 제모한다.</li>
			<li>공백 MN 패치군: 3BDO@MN 그룹과 동일한 일정에 따라 3BDO가 포함되지 않은 MN 패치로 제모된 피부를 처리한다.</li>
			<li>3BDO@MN 패치군: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13일에 3BDO@MN 패치로 제모된 피부를 처리한다.</li>
			<li>PBS 피하 주사군: 매일 마우스의 제모된 등 부위에 PBS 용액을 피하 주사한다.</li>
			<li>3BDO 피하 주사군: 매일 마우스의 제모된 등 부위에 3BDO 용액을 피하 주사한다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>제모된 피부에 3BDO@MN 패치를 부착하고, MN이 피부에 확실히 삽입되도록 수직으로 균일한 압력을 가한다. 탄력 붕대로 3BDO@MN 패치를 고정하고 직선 클램프를 사용하여 붕대를 유지한다. 
		&#8203;참고: 각 전략의 서로 다른 전달 특성에 따라 투여 일정을 다르게 설정하였다. 3BDO@MN 패치는 국소적인 지속 방출을 제공하는 반면, 피하 주사는 3BDO를 일시 투여(bolus dose) 방식으로 전달한다.</li>
		<li>실험 전 과정 동안 마우스를 관찰하여 마취에서 완전히 회복되었는지 확인한다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>시료 수집 및 모발 성장 평가
	<ol>
		<li>모발 성장을 기록하기 위해 매일 마우스의 등 피부를 촬영한다.</li>
		<li>15일에 모간 직경, 모발 피복도 및 모발 밀도를 측정하여 모발 재생을 평가한다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 처리 부위의 모발 피복도 백분율을 정량화한다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhou C, Li X, Wang C, Zhang J. Alopecia areata: an update on etiopathogenesis, diagnosis, and management. Clin Rev Allergy Immunol. 2021;61(3):403-23.</li>
	<li>Rudnicka L. Hair loss is a symptom of many complex medical and psychological problems. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2023;37(8):1460-1.</li>
	<li>Alessandrini A, Bruni F, Piraccini BM, Starace M. Common causes of hair loss: clinical manifestations, trichoscopy and therapy. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2021;35(3):629-40.</li>
	<li>Zhao X et al. Long noncoding RNA CA7-4 promotes autophagy and apoptosis via sponging MIR877-3P and MIR5680 in high glucose-induced vascular endothelial cells. Autophagy. 2020;16(1):70-85.</li>
	<li>Wang L et al. An effective pharmacological hydrogel induces optic nerve repair and improves visual function. Sci China Life Sci. 2024;67(3):529-42.</li>
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	<li>Cao Y et al. Dissolvable microneedle-based wound dressing transdermally and continuously delivers anti-inflammatory and pro-angiogenic exosomes for diabetic wound treatment. Bioact Mater. 2024;42:32-51.</li>
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	<li>Nareswari A et al. Development and validation of a C57BL/6 mouse model of androgenetic alopecia through testosterone propionate induction. Trends Sci. 2026;23(8):12711.</li>
	<li>Liu M, He G, Wang F, Wang Y. In vivo non-invasive observation of dynamic changes in hair shaft, melanin, and collagen during the C57BL/6 follicle cycle. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.09.15.676351.</li>
	<li>Vora LK et al. Long-acting microneedle formulations. Adv Drug Deliv Rev. 2023;201:115055.</li>
	<li>Xiang H et al. Dissolving microneedles for alopecia treatment. Colloids Surf B Biointerfaces. 2023;229:113475.</li>
	<li>Xiao T et al. Microneedle assisted delivery of epidermal and dermal stem cells to promote hair growth. J Mater Sci. 2024;59(19):8427-40.</li>
</ol>

저자들은 선언할 이해상충 관계가 없습니다.

현재 AGA의 임상 치료는 주로 약물학적 중재와 수술적 이식으로 분류됩니다. 본 연구에서는 3BDO가 적재된 MNs가 C57BL/6 마우스 모델에서 모발 재생을 촉진했습니다. 그러나 기존의 약물 전달 방법은 약물의 불균일한 분포와 같은 한계가 있습니다. 본 연구의 핵심 프로토콜은 3BDO 적재 MNs를 제조하기 위한 2단계 방법입니다. HA와 CS는 MNs의 주요 성분입니다. MNs의 품질을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계에서 주의가 필요합니다.
첫째, 폴리머 용액 내에 기포가 갇히는 것을 방지하기 위해, 원심 분리 중 용매 증발 속도를 늦추고자 사전 냉각된 몰드를 사용하였습니다. 둘째, 건조 조건은 팁의 취성과 배킹층의 무결성에 직접적인 영향을 미칩니다. 습도가 제어된 36 °C에서 16 h 동안 건조하여 배킹층의 유연성을 유지하면서 과건조를 방지함으로써, 팁이 충분한 기계적 강도를 갖도록 하였습니다. 셋째, 134 × g의 속도로 5 min 동안 원심 분리하는 것이 팁 영역에 3BDO를 효과적으로 농축시키지만, 더 높은 속도나 더 긴 시간은 몰드 바닥에서 약물 침전을 유발하여 전달 효율을 감소시킬 수 있습니다. in vivo 시험을 위해, C57BL/6 마우스를 모발 재생 모델로 사용하였습니다. C57BL/6 마우스의 모낭은 가시적이고 고도로 동기화된 모발 성장 주기를 보여주어 실험적 편의성을 제공하며, 피부 질환 연구에서 가장 일반적인 모델 중 하나로 사용됩니다16. 약 7주령에 C57BL/6 마우스의 모낭은 자연스럽게 휴지기로 진입합니다. 마우스의 모발을 인위적으로 제모한 후, 모낭은 즉시 성장기로 재진입합니다17. in vivo 시험 결과, 본 모델에서 MN 시스템이 피하 주사보다 더 균일한 모발 재생을 촉진하는 것으로 나타났습니다.
3BDO@MN 시스템은 모발 재생 소분자와 최소 침습적 경피 전달 플랫폼을 결합함으로써 탈모 치료를 위한 유망한 전임상 전략이 될 수 있습니다. 지속성 마이크로니들 제형은 약물의 제어 방출 또는 서방형 방출을 가능하게 하여 투여 빈도를 줄이고 환자의 순응도를 개선함으로써, 기존의 국소 또는 전신 치료와 관련된 일부 한계점을 해결하는 것으로 보고되었습니다18,19. 또한, 줄기세포 전달을 포함한 최근의 마이크로니들 보조 모발 재생 전략은 이 분야에서 마이크로니들 플랫폼의 광범위한 적용 가능성을 더욱 뒷받침합니다20. 그럼에도 불구하고, 임상 적용에 앞서 장기적인 생체 안전성, 약동학/약력학 프로파일, 용량 최적화, 저장 안정성 및 대량 생산 가능성을 평가하기 위한 추가 연구가 여전히 필요합니다.

안드로젠성 탈모증(AGA)은 가장 흔한 임상적 탈모 질환 중 하나로, 주로 두피 모발의 점진적인 가늘어짐과 탈락을 특징으로 합니다. 남성들 사이에서 평생 유병률이 지속적으로 높게 나타나며, 이는 시급한 해결이 필요한 중요한 건강 문제입니다1,2. 현재 AGA의 임상적 치료는 주로 약물적 중재와 외과적 이식으로 분류되나, 두 방법 모두 상당한 단점이 있습니다. 피나스테리드 및 미녹시딜과 같은 1차 치료제는 어느 정도의 치료 효과를 보이지만, 성기능 장애, 두피 가려움증 및 두피 건조증과 같은 명확한 부작용을 동반합니다1,3. 모발 이식은 국소적인 모발 재생을 달성할 수 있지만, 높은 치료 비용, 공여 부위의 불충분한 모발 양, 그리고 변동성이 큰 이식 생존율로 인해 제한적이며, 이로 인해 임상 현장에서 널리 보급되기 어렵습니다1. 이러한 한계로 인해 효과, 안전성 및 환자 순응도를 결합한 새로운 치료 전략이 필요합니다.
3BDO는 rapamycin과 경쟁하는 저분자 mTOR 활성제입니다4. 이는 다양한 시스템에서 오토파지 억제제로 널리 사용되어 왔습니다5,6,7. 예를 들어, 3BDO를 장기간 처리하면 오토파고좀의 수를 감소시켜 기억 기능을 개선할 수 있습니다8. 또한, 3BDO가 mTOR 활성제로서 독립적으로 작용할 수 있다는 증거들이 축적되고 있습니다. 일례로, 3BDO는 mTOR 활성과 관계없이 마우스의 혈관 내피세포 사멸과 죽상동맥경화증 진행을 저해했습니다9. 하지만 모낭 성장에 있어 3BDO의 잠재적 역할은 보고된 바 없습니다. 특히, 본 연구진의 예비 연구에서 3BDO가 모발 재성장을 촉진하는 것으로 나타났습니다. 그러나 전통적인 국소 약물 전달 방법에는 명백한 한계가 있습니다. 피부의 각질층은 경피 효율을 제한하여 진피 내 모낭 표적 부위로 약물을 전달하는 것을 어렵게 만듭니다. 경피 젤은 약물의 체류 시간을 연장할 수 있지만, 원치 않는 잔여물을 남길 수 있습니다. 위에서 언급한 두 치료 전략 모두 임상적 효능이 여전히 최적화되지 않은 상태입니다10,11.
마이크로니들(MNs)은 각질층을 쉽게 투과하여 표피와 진피의 접합부인 모낭 주변 미세환경에 약물을 정확하게 전달할 수 있다는 점이 핵심 장점인 새로운 무통 약물 전달 기술입니다. 또한, MNs는 사용이 편리하고 침습성이 낮으며 비용이 합리적이라는 특징이 있습니다12,13,14. 국소 도포용 3BDO의 경피 전달 병목 현상을 해결하기 위해, 히알루론산(HA)을 매트릭스로, 키토산(CS)을 기능성 성분으로 사용하는 MN 패치가 개발되었습니다. CS의 함유는 항균 잠재력을 가진 기능성 성분을 제공하기 위한 것입니다. 더욱이, 탈모가 있는 생쥐 피부에 HA를 적용하면 모낭 발달을 유의미하게 자극할 수 있습니다15. 따라서 본 프로토콜에서는 3BDO가 탑재된 용해성 MN 시스템의 제작 및 특성 분석과, 제모된 C57BL/6 생쥐 모발 재생 모델에서의 적용 방법을 설명합니다. 이 모델은 제모 후의 모발 재생 반응을 평가하는 데 유용하지만, 그 자체로 AGA에 대한 임상적 효능을 입증하는 것은 아닙니다.

<table><tbody><tr><td>3BDO</td><td>Yuanye Bio-Technology Co., 중국 상하이</td><td>890405-51-3</td><td>3BDO가 탑재된 CS/HA 제형의 제조</td></tr><tr><td>6-웰 플레이트</td><td>Corning Incorporated, USA</td><td>참조 3516</td><td>항균 분석 및 인비트로(in vitro) 약물 방출 분석</td></tr><tr><td>75% 에탄올</td><td>Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.</td><td>1202050004</td><td>소독</td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Corning Incorporated, USA</td><td>REF3599</td><td>세포 독성 평가 및 항균 분석</td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>Charles River Laboratories</td><td>7주</td><td>동물 실험</td></tr><tr><td>세포 계수 키트-8 (CCK-8)</td><td>Dojindo, 일본</td><td>CK04</td><td>세포독성 평가</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75007204</td><td>제형 원심분리기</td></tr><tr><td>키토산 (CS)&amp;nbsp;</td><td>Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.</td><td>9012-76-4</td><td>CS/HA 제형 준비</td></tr><tr><td>제모 크림</td><td>Veet</td><td>3059944023307</td><td>제모</td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd</td><td>67-68-5</td><td>3BDO가 함유된 CS/HA 제형의 제조</td></tr><tr><td>전자저울</td><td>Radwag</td><td>AS 220.R2</td><td>분말 무게 측정</td></tr><tr><td>에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)</td><td>ATCC</td><td>/</td><td>항균 분석</td></tr><tr><td>히알루론산(HA) 분말</td><td>Bloomage Biotechnology Co. 중국</td><td>9067-32-7</td><td>CS/HA 제형 준비</td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>미국 국립보건원</td><td>/</td><td>통계 분석</td></tr><tr><td>배양 진탕기</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>50163013</td><td>박테리아 배양</td></tr><tr><td>이소플루레인 기화기</td><td>유전자&amp;amp;I</td><td>AMS</td><td>동물 마취</td></tr><tr><td>LB 배지</td><td>Sigma Life Science</td><td>L3022</td><td>항균 분석</td></tr><tr><td>자기 교반기</td><td>Hangzhou MiuLab Instrument Co., Ltd.</td><td>SP-16</td><td>제형 교반</td></tr><tr><td>Multiskan SkyHigh 마이크로플레이트 분광광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>/</td><td>OD 측정</td></tr><tr><td>오븐</td><td>상하이 후이타이 계기 제조 유한공사(Shanghai Huitai Instrument Manufacturing Co.,Ltd)</td><td>DHG-9260A</td><td>마이크로니들 건조</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Amcor&amp;nbsp;</td><td>PM-996</td><td>마이크로니들 밀봉</td></tr><tr><td>인산 완충 용액 (PBS)</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td>인 비트로(in vitro) 약물 방출 분석</td></tr><tr><td>황색포도상구균 (S. aureus)</td><td>ATCC</td><td>/</td><td>항균 분석</td></tr><tr><td>범용 TA 질감 분석기</td><td>Shanghai Tengba Instrument Technology Co., Ltd</td><td>/</td><td>기계적 강도 시험</td></tr><tr><td>진공 챔버</td><td>Shanghai Huitai Instrument Manufacturing Co.,Ltd</td><td>DZF-6050</td><td>진공 건조</td></tr></tbody></table>

c57bl/6 마우스의 모발 재생을 위한 3bdo 함유 용해성 마이크로니들 패치의 제작 및 특성 분석

Fabrication and Characterization of 3BDO-Loaded Dissolvable Microneedle Patches for Hair Regrowth in C57BL/6 Mice

안드로겐성 탈모증(AGA)에 대한 기존 치료법에는 한계가 있어 대안적인 전달 방식에 대한 연구가 추진되고 있습니다. 본 프로토콜에서는 C57BL/6 마우스 모발 재생 모델을 대상으로 3BDO가 탑재된 히알루론산/키토산(HA/CS) 용해성 마이크로니들(MN) 패치의 제작, 특성 분석 및 적용 방법을 설명합니다. 이 방법은 폴리디메틸실록산(PDMS) 몰드에서 2단계 성형 공정을 사용하여, 약물이 없는 HA/CS 지지층을 형성하는 동시에 니들 팁에 3BDO를 농축시킵니다. 패치는 주사전자현미경(SEM) 이미지 촬영, 기계적 테스트, 피부 삽입 및 용해 테스트, in vitro 방출 테스트, 항균 분석, 세포독성 테스트 및 in vivo 모발 재생 평가를 통해 특성을 분석합니다. 삽입 시 MN 팁이 용해되면서 3BDO를 국소적으로 방출합니다. In vivo 평가 결과, 3BDO 탑재 MN 그룹이 피하 주사 및 대조군보다 더 균일한 모발 재생을 보였습니다. 또한 본 프로토콜은 패치의 형태, 삽입 성능 및 국소 생체 적합성 평가를 지원합니다. 이 방법은 모발 재생 응용을 위한 3BDO의 MN 매개 전달을 평가하는 전임상 워크플로우를 제공합니다.

본 프로토콜에서는 3BDO@MN 패치의 제작 및 특성 분석 방법을 제시합니다. 그림 1 은 3BDO@MN 패치의 제작 공정 개요도를 보여줍니다. 3BDO를 CS/HA 포뮬레이션에 혼합한 후, 이 매트릭스 혼합물을 PDMS MN 몰드에 넣고 원심분리하여 바늘 끝부분을 채웠습니다. 3BDO가 포함되지 않은 CS/HA 매트릭스 혼합물을 몰드 표면에 추가하고 원심분리하여 지지층을 채웠습니다. 완전히 건조시킨 후, 패치를 떼어내어 3BDO@MN 패치를 얻었습니다. 그림 2A에서 보는 바와 같이, SEM을 통해 MN의 형태를 분석하였습니다.
원뿔형 마이크로니들은 15 × 15 mm 패치 위에 20 × 20 배열로 균일하게 형성되었으며, 각각의 바닥 너비는 250 µm 및 높이는 600 µmMN 팁은 1.2 N의 힘을 견뎠으며, 이는 피부 투과에 충분한 수치임이 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 통해 관찰된 명확한 삽입 핀홀로 입증되었습니다.&amp;E) 염색 (그림 2B,C). 그 후 마우스의 등 피부를 사용하여 3BDO@MN 패치의 적용 시험을 수행하였습니다. 패치를 마우스 피부에 압착하여 용해 시간을 측정한 결과, 마이크로니들(MN) 팁이 60초 이내에 완전히 용해되었습니다 (그림 2D). 다음의 체외(in vitro) 분석 결과, MN으로부터 3BDO의 방출 프로파일을 통해 약 90%의 약물이 방출되었음을 확인하였다(그림 2E). MN 추출물은 표피 및 진피 세포에서 세포독성을 나타내지 않았으며, 반면 1 µM 3BDO는 세포 성장을 유의하게 촉진했습니다 (그림 2F). 키토산 함유 제형은 두 가지 모두에 대해 농도 의존적인 항균 활성을 나타냈다. E. coli 및 S. aureus, 10 mg/mL를 초과하는 농도에서 그 효과가 더 뚜렷하게 나타나며 (그림 2G,H). 이러한 결과는 키토산을 MN 제형의 기능성 성분으로 사용하는 것을 뒷받침하지만, 실제 적용 조건에서의 항균 성능을 확인하기 위해서는 최종 제작된 패치에 대한 추가 테스트가 필요할 것이다.
동물 실험 결과, 3BDO@MN 그룹은 5일 차에 유의미한 피부 색소 침착을 나타냈습니다. 15일 차까지 3BDO 주사 투여 그룹은 약 45%의 모발 피복도를 보인 반면, 대조군은 약 39%를 나타냈으며, 3BDO@MN 그룹은 약 90%의 피복도를 달성했습니다(그림 3). 3BDO@MN 그룹의 모발 재생은 더 균일하고 조밀하게 나타났으며, 이는 직접 주사 방식보다 약물 투과 및 유지력이 더 뛰어남을 시사합니다.
종합하면, 이러한 결과는 MN을 통한 3BDO 전달이 본 연구에서 사용된 제모된 C57BL/6 마우스 모델에서 모발 재성장을 촉진했음을 나타냅니다. 이 접근 방식이 안드로겐성 탈모의 질환 특이적 모델 및 임상적으로 유의미한 투여 조건 하에서도 효과적인지 결정하기 위해 추가 연구가 필요합니다.
<img alt="3D 바이오프린팅 공정 도식: 3BDOQCS/HA 코팅, 원심분리, 진공 건조, CS/HA 매트릭스." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71814/71814fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 1"> 
그림 1. 3BDO@MNs의 제조 공정 모식도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71814/71814fig1large.jpg" target="_blank">여기에서 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.</a>
<img alt="마이크로니들 어레이 도식 및 세포 생존율 그래프; 젖산 키토산의 항균 특성에 관한 연구." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71814/71814fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 2"> 
그림 23BDO@MN 시스템의 제작 및 특성 분석. (A) 3BDO@MNs의 형태를 보여주는 SEM 이미지. 스케일 바 = 500 µm. (B) 3BDO@MNs의 힘-변위 곡선. (C) H&amp;3BDO@MNs 삽입 및 기저부 제거 후 E-염색된 마우스 피부 단면으로, 조직 침투가 성공적으로 이루어졌음을 확인함. 스케일 바 = 100 µm. (D) 피부 삽입 후 5초, 10초, 30초 및 60초에서의 MN 용해 과정을 보여주는 SEM 이미지. (E) 누적 인비트로(in vitro) MNs로부터의 3BDO 방출 프로파일. (F) 3BDO, MN 추출물 및 이를 함유한 MN 추출물로 처리한 표피 세포와 진피 세포의 세포 생존율 24시간 시점의 3BDO. (G,H) 620 nm에서의 흡광도 (G) Staphylococcus aureus 및 (H) Escherichia coli 다양한 농도의 키토산이 포함된 배지에서 배양된 현탁액. 데이터는 평균 ± 표준편차(n = 3)로 표시하였으며, 통계적 유의성은 일원 분산 분석(one-way ANOVA)으로 분석하였다(**p &lt; 0.01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71814/71814fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="마이크로니들(MN) 패치를 이용한 모발 성장 실험; 마우스의 색소 침착 및 모발 피복도 결과." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71814/71814fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 3"> 
그림 33BDO@MNs의 모발 재생 효과 in vivo(A) 동물 실험의 모식도. (B) 처치 후 0일차(제모), 5일차, 10일차 및 15일차의 마우스 등 피부 대표 이미지. (C) ~ 내 색소 침착 점수(임의 단위)의 정량적 분석 (B). (D) 처치 영역 내 모발 피복 면적(%)의 정량적 분석 (B). (E) 대조군 대비 처리 부위의 모발 피복 면적의 상대적 배수 변화. 데이터는 평균 ± 표준편차(n = 5)로 나타냈으며, 통계적 유의성은 일원 분산 분석(one-way ANOVA)으로 분석하였다(**p &lt; 0.01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71814/71814fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>

본 프로토콜은 마우스 모발 재생 모델에서의 경피 약물 전달을 위한 3BDO 함유 용해성 마이크로니들 패치의 제작, 특성 분석 및 적용 방법을 설명합니다.

C57BL/6 마우스의 모발 재생을 위한 3BDO 함유 용해성 마이크로니들 패치의 제작 및 특성 분석

안드로젠성 탈모증(AGA)에 대한 기존 치료법은 한계가 있어, 대안적인 전달 방식에 대한 연구가 추진되고 있습니다. 본 프로토콜에서는 ...을(를) 기술합니다.

fabrication-characterization-3bdo-loaded-dissolvable-microneedle

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

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