Name: DNA-FISH 중기는 인간 암 세포주에서 균질하게 염색된 영역과 염색체 외 DNA를 구분하기 위해 확장됩니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-04T13:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 학습하세요 DNA-FISH 중기 분열상 방법을 통해 인간 암 세포주에서 염색체 외 DNA와 균질하게 염색된 영역을 단일 세포 수준에서 구분하는 기술을. 이 프로토콜은 암 유전자 증폭 구조 연구에 필수적인 도구입니다.

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dna-fish 중기는 인간 암 세포주에서 균질하게 염색된 영역과 염색체 외 dna를 구분하기 위해 확장됩니다

DNA-FISH Metaphase Spreads to Distinguish Extrachromosomal DNA from Homogeneously Staining Regions in Human Cancer Cell Lines

DNA-FISH 중기는 인간 암 세포주에서 균질하게 염색된 영역과 염색체 외 DNA를 구분하기 위해 확장됩니다

Whole-genome sequencing identifies focal DNA amplifications with base-pair resolution but cannot determine whether amplified sequences reside on ...

본 연구는 증폭된 온코진(oncogenes)이 염색체 외 DNA(ecDNA)에 존재하는지, 아니면 염색체 내에 통합된 별도의 균질 염색 부위(HSR) 내에 존재하는지를 결정하는 데 중점을 둡니다. 시퀀싱으로는 ecDNA와 HSR 증폭을 구분할 수 없으므로, 본 프로토콜은 이를 단일 세포 해상도로 분석하여 해결합니다.우선, Colcemid 스톡 용액을 멸균 초순수로 1:1 비율로 희석합니다. 중기 정지를 위해, 대수 성장기이며 70%에서 90% 정도의 합류도(confluence)로 10 mL 배지에서 배양 중인 COLO320DM 세포에 희석된 Colcemid 용액 100 µL를 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 45분부터 하룻밤 동안 배양합니다. 메탄올과 아세트산을 3:1 비율로 혼합하여 신선한 Carnoy 고정액을 준비합니다. 고정 과정 내내 Carnoy 고정액을 얼음 위에 보관하십시오. 신선한 0.075 M 염화칼륨 용액을 준비하고 37 °C 항온수조에서 가온합니다. 원심분리와 세포 계수 후, PBS로 세포를 세척합니다. 가온된 0.075 M 염화칼륨 용액 10 mL에 세포를 조심스럽게 재부유시키고, 부드럽게 도립 혼합하여 현탁액을 섞습니다. 세포를 37 °C 항온수조에서 30분 동안 배양합니다. 도립 혼합으로 현탁액을 조심스럽게 섞으면서 얼음처럼 차가운 Carnoy 고정액 2 mL를 천천히 첨가합니다. 세포를 5분 동안 방치한 후, 상온에서 500 g로 5분간 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 얼음처럼 차가운 Carnoy 고정액 10 mL를 0.5 mL씩 천천히 첨가하며, 매 첨가 후 현탁액을 부드럽게 혼합하고 세포를 10분 동안 방치합니다. 상온에서 650 g로 5분간 원심분리합니다. 마지막 세척 단계에서는 세포를 Carnoy 고정액에 부유된 상태로 둡니다.유리 슬라이드에 라벨을 붙이고 얼음 위에 둡니다. P1000 피펫을 사용하여 세포를 Carnoy 고정액 1mL당 약 500만 개의 세포가 되도록 재부유시킵니다. 고정된 세포 현탁액 약 300µL를 1.5mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. P200 피펫을 사용하여 샘플을 여러 번 위아래로 피펫팅하여 완전히 재부유시킵니다. 재부유된 세포 60µL를 흡입한 후, 얼음 위에 놓인 유리 슬라이드에서 약 1m 높이에 피펫 팁을 유지하고 슬라이드 중앙을 겨냥합니다. 세포 현탁액을 슬라이드 위에 천천히 분주합니다. 슬라이드를 80°

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연구

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