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</ol>

<table><tbody><tr><td>1 mL Tuberculin Syringes</td><td>벡톤 딕킨슨</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>10% Buffered Formalin Phosphate</td><td>피셔 케미컬</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>70% Isopropyl Alcohol Swabs</td><td>카디널 헬스</td><td>S-16183</td><td></td></tr><tr><td>Angled sharp forceps</td><td>듀몽</td><td>I I25 I-35</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip 9mm (Skin stapler)</td><td>미크론</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>베타딘</td><td>아틀란티스 컨슈머 헬스케어</td><td>67618-155-16</td><td></td></tr><tr><td>면화 거즈 패드</td><td>다이너렉스 코퍼레이션</td><td>3223</td><td></td></tr><tr><td>면화 팁 애플리케이터</td><td>퓨리탄 메디컬 제품</td><td>25-806 2WC</td><td></td></tr><tr><td>돼지 췌장 엘라스타제 (단백질 mg당 4.0 단위 이상)</td><td>시그마-알드리히</td><td>E1250</td><td>수용액 4 ℃에서 보관</td></tr><tr><td>쥐 췌장 엘라스타제 (단백질 mg당 4.75 단위)</td><td>엘라스틴 제품 주식회사</td><td>MS838</td><td>수용액 (0.1 mg in 1 mL PBS) 4 ℃에서 보관</td></tr><tr><td>엘라스틴</td><td>MP 바이오메디컬</td><td>101636</td><td>수용액 4 ℃에서 보관</td></tr><tr><td>Enersight 데스크탑 소프트웨어</td><td>라이카</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/enersight/</td><td></td></tr><tr><td>Ethiqa XR (수정 방출 부프레노르핀)</td><td>피델리스</td><td>NDC 86084-100-30</td><td></td></tr><tr><td>안약</td><td>옵틱스케어</td><td>Opx-4242</td><td></td></tr><tr><td>Flexacam i5 (스테레오)</td><td>라이카</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-cameras/p/12730536-leica/</td><td></td></tr><tr><td>프뢰이드의 완전 보조제</td><td>MP 바이오메디컬</td><td>642851</td><td>수용액 4 ℃에서 보관</td></tr><tr><td>프뢰이드의 불완전 보조제</td><td>MP 바이오메디컬</td><td>642861</td><td>수용액 4 ℃에서 보관</td></tr><tr><td>장갑 (멸균)</td><td>앵코르</td><td>7824PF</td><td></td></tr><tr><td>피하 주사 바늘 (23 G)</td><td>벡톤 딕킨슨</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>피하 주사 바늘 (27 G)</td><td>벡톤 딕킨슨</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>아이소스파이어 (아이소플루란)</td><td>데크라 수의학</td><td>07-894-8943</td><td></td></tr><tr><td>라벨링 테이프</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>15959</td><td></td></tr><tr><td>마스크</td><td>듀칼 코퍼레이션</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>바늘 드라이버</td><td>스칸란</td><td>6006-36</td><td></td></tr><tr><td>Omnicon F/air 마취 가스 캔이스터</td><td>A.M. 빅퍼드 인코퍼레이티드</td><td>80120</td><td></td></tr><tr><td>Press'N Seal</td><td>글래드</td><td>12587704417</td><td></td></tr><tr><td>RC2 설치류 회로 컨트롤러</td><td>베트 에퀴프 인코퍼레이티드</td><td>922100</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater 안정화 용액</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>파인 사이언스 툴</td><td>14005-12</td><td></td></tr><tr><td>피부 스테이플 (클립)</td><td>미크론</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>소형 설치류 워머 히터</td><td>스토엘팅</td><td>53851</td><td></td></tr><tr><td>소형 설치류 워머 스테이지</td><td>스토엘팅</td><td>53812</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경 M60</td><td>라이카</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m80/</td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 샤프 포스펙스</td><td>듀몽</td><td>I I 25 I-30</td><td></td></tr><tr><td>SurgiSuite 자기 고정 자동 견인 장치 세트 및 스테이지</td><td>켄트 사이언티픽</td><td>13-005-180</td><td></td></tr><tr><td>타호 휴대용 산소 농축기</td><td>베틀랜드 메디컬</td><td>595-2300A</td><td></td></tr><tr><td>톱니 포스펙스</td><td>파인 사이언스 툴</td><td>11043-08, 11042-08</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 초음파</td><td>후지필름 비주얼소닉스</td><td>EDU00496</td><td></td></tr><tr><td>Visorb 폴리글리콜산 봉합사</td><td>CP 메디컬</td><td>397A</td><td></td></tr><tr><td>VWR 흡수제</td><td>VWR</td><td>95057-860</td><td></td></tr></tbody></table>

엘라스틴 감작과 혈관 주위 엘라스타제를 이용한 쥐 복부 대동맥류 모델의 신뢰성 높은 생성

Reliable Creation of a Murine Abdominal Aortic Aneurysm Model Using Elastin Sensitization and Perivascular Elastase

Degradation of the elastic lamellar matrix in the abdominal aortic wall is a histopathologic feature of abdominal aortic aneurysms (AAA). Growing evidence ...

본 연구진은 새로운 예방 치료법을 연구하기 위해 면역 감작 성분이 포함된 대동맥류 모델을 개발했습니다. 이러한 모델은 높은 사망률이나 불일치한 대동맥 확장으로 인해 구현이 까다롭습니다. 본 연구에서는 이러한 합병증을 제한하기 위해 엘라스틴 감작법을 사용합니다.먼저 장갑, 보안경, 마스크를 포함한 개인 보호 장구를 착용하십시오. 단백질 mg당 4.75 units의 마우스 췌장 엘라스타제를 준비합니다. 5 mg의 마우스 엘라스틴에 엘라스타제 168 µL를 첨가하십시오.그 다음, 혼합물에 1X PBS 200 µL를 추가합니다. 엘라스타제(elastase)와 엘라스틴(elastin) 혼합물을 37 °C에서 간헐적으로 부드럽게 흔들어주며 20분 동안 배양합니다. 이어서, 엘라스타제와 엘라스틴 혼합물에 차가운 PBS 632 µL를 추가하고, 이어서 complete Freund's adjuvant 1 mL를 추가합니다.마취된 13주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 37 °C로 예열된 스테이지 위에 복와위로 놓으며, 마우스의 코 위에 마취용 노즈콘을 위치시킵니다. 준비된 EDP 혼합액 50 µL를 마우스의 양측 옆구리에 피하 주사합니다. 수건을 깐 회복 바스켓에 담아 37 °C로 가열된 스테이지 위에 마우스를 둡니다.마우스가 마취에서 깰 때까지 모니터링합니다. 최초 엘라스틴 감작 7일 후, 동맥류 유발 수술을 위한 수술대를 준비합니다. 5.1 mg/mL 돼지 췌장 엘라스테이스 27 µL와 PBS 73 µL를 혼합하여 작동 엘라스테이스 용액을 조제합니다.마취된 마우스를 37 °C의 가열 스테이지 위에 등으로 누운 자세(supine)로 배치합니다. 마우스의 코를 마취용 노즈콘에 위치시킵니다. 체중 1kg당 3.25mg의 서방형 부프레노르핀을 피하 주사합니다.라벨링 테이프를 사용하여 뒷다리를 스테이지에 고정합니다. 눈에 윤활제를 도포하고 동물의 발가락을 꼬집어 마취 깊이를 확인합니다. 그런 다음 복부 털을 제거하고 수술 부위를 준비합니다.수술용 메스를 사용하여 복부 정중앙에 약 3cm 길이의 절개를 가합니다. 음경에서 머리 쪽으로 0.5~1cm 떨어진 지점에서 시작하여 검상돌기에서 꼬리 쪽으로 0.5cm 떨어진 지점까지 절개합니다. 치과용 포셉을 사용하여 피부를 잡고 부드럽게 위로 당깁니다.피부를 계속해서 위로 당기면서 가위로 백선을 확인하고 절개합니다. 복강 내 구조물이 손상되지 않도록 주의하십시오. 자석식 자가 유지 견인기를 사용하여 복벽과 방광, 정낭과 같은 미측 구조물을 견인합니다.물에 적신 면봉을 사용하여 장을 제거합니다. 습윤 상태의 5x5 centimeter 거즈로 장을 덮습니다. 후방 중앙선에서 하대정맥과 복부 대동맥을 확인합니다.면봉을 사용하여 후방 혈관 구조물 위의 조직면을 조심스럽게 열어 후복막으로 진입합니다. 그 다음, 견인력을 높이고 대동맥 시야를 확보하기 위해 외측 견인기를 더 깊게 배치합니다. 면봉을 사용하여 하대정맥을 신장 하부 복부 대동맥으로부터 분리합니다.이 단계에서는 측면 대동맥 부착부를 분리하지 마십시오. 하대정맥과 대동맥 사이의 층을 박리하여 삼각형 공간이 보일 때까지 진행합니다. 둔성 박리법이나 날카로운 포셉을 사용하여 마우스 왼쪽의 측면 대동맥 부착부를 결합 조직 및 요근으로부터 분리하십시오.다음으로, 각진 날카로운 핀셋을 삼각형 공간에 넣습니다. 핀셋을 부드럽게 반복적으로 벌리고 닫아 대동맥 후방 부착 부위를 분리합니다. 동일한 개폐 동작을 사용하여 대동맥을 따라 머리 쪽에서 꼬리 쪽 방향으로 후방 평면을 확보한 후, 전체 대동맥의 비디오 마이크로미터리 이미지를 촬영하여 분석을 위해 저장합니다.피펫을 사용하여 13.8 µg의 elastase가 포함된 용액 10 µL를 노출된 대동맥 길이를 따라 떨어뜨립니다. 적신 5x5 cm 거즈 패드를 열린 복부 위에 올리고 10분 동안 대기합니다. 그 후, 거즈를 제거하고 멸균 PBS로 복부를 3회 세척하여 잔류 elastase 용액을 제거합니다.복부 장기들을 원래 위치로 되돌리고 장의 꼬임이나 꺾임이 있는지 확인하여 교정합니다. 치아형 포셉(toothed forceps)을 사용하여 복직근과 근막을 피부에서 박리하여 0.25-centimeter 두께의 피부 플랩을 만듭니다. 복부 근막을 4-0 땋은 polyglycolic acid 봉합사로 단순 연속 봉합법을 이용하여 봉합합니다.절개 부위의 모서리를 포함하여 봉합하며, 스테이플 간격을 2 mm 미만으로 유지합니다. 3~4개의 스테이플을 사용하여 상단의 피부를 함께 고정합니다. 수건이 깔린 회복 바구니에 마우스를 넣고 37 °C로 가열된 스테이지 위에 둡니다.마우스가 마취에서 깨어날 때까지 관찰하십시오. 수술 7일 후, 초음파 검사를 실시하여 동맥류의 성장을 모니터링합니다. 그런 다음, 불완전 프룬드 보조제(incomplete Freund's adjuvant)를 사용하여 신선한 EDP 혼합물을 준비하고, 앞서 설명한 엘라스틴 감작 절차를 반복하십시오.수술 후 21일째에 형태학적 및 분자 분석을 위해 혈액과 조직 샘플을 수집합니다. 21일째에 기저치 대비 평균 대동맥 직경 비율은 초음파와 비디오 마이크로메트리 측정 모두에서 가성동맥류 군이 가짜 수술 대조군보다 유의하게 높았습니다. 21일째 조직 채취 후 대동맥 단면의 대표적인 조직학적 영상에서는 내막이 두꺼워진 상태로 세포 침윤이 관찰되었습니다.동맥류가 발생한 대동맥 주변에서 상당한 콜라겐 침착이 관찰되었습니다. 동맥류 모델에서는 층판 엘라스틴이 얇아지거나 파편화되었으며, 일부는 소실된 반면, 비동맥류 구역에서는 두껍고 뚜렷한 엘라스틴 층이 관찰되었습니다. 정상 대동맥과 비교했을 때, 동맥류 대동맥은 신장하 분절 전체적으로 육안상 더 컸으며, 대동맥 분지점 부근에서 더 넓은 확장 부위가 나타났습니다.본 프로토콜을 통해 대동맥류에서 대동맥 확장, 염증성 변화, 면역 반응 및 예방 치료의 효과를 연구할 수 있습니다. 복부 대동맥을 충분히 노출시키는 것과 동물의 생존율 사이의 균형을 맞추는 것이 본 프로토콜의 핵심적인 판단 단계입니다. 향후 연구에서는 대동맥류의 진행을 억제하기 위해 다양한 엘라스틴 분해 산물 제제, 세포 치료 및 생물학적 치료법을 평가할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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